| 17.
Diagnóstico microbiológico de la infección por
Helicobacter pylori. 2004 |
| Coordinador: |
Manuel López-Brea |
| Autores: |
Teresa Alarcón |
|
Margarita
Baquero |
|
Diego Domingo |
|
Manuel López-Brea |
|
Gloria Royo |
|
DOCUMENTO
CIENTÍFICO
1.
INTRODUCCIÓN
Helicobacter pylori es un bacilo gramnegativo, curvado y
microaerofílico que se encuentra en la mucosa gástrica
del estómago humano asociado a diferentes enfermedades
digestivas. H. pylori tiene una morfología espiral en
forma de sacacorchos cuando se encuentra en la mucosa gástrica
y menos espiral cuando crece en medios artificiales. Presenta unas
dimensiones de 0,5 a 1,0 µm de ancho y de 3 µm de largo y
las características estructurales típicas de los bacilos
gramnegativos, con una membrana externa. Tiene de 4 a 8 flagelos
polares, fundamentales para su movilidad, y que están
recubiertos por una vaina de estructura lipídica, igual que la
membrana externa, que parece tener la misión de proteger a los
flagelos de su degradación por el medio ácido. Su
característica bioquímica más importante es la
ureasa, considerablemente más potente que la de otras
bacterias. Tiene otras dos enzimas muy útiles para su
identificación cuando crece en medios de cultivo que son la
oxidasa y la catalasa.
La infección por H. pylori es una de
las más comunes en el hombre y aunque ocurre en todo el mundo,
es más frecuente en los países en desarrollo y la
prevalencia disminuye cuando aumenta el nivel socioeconómico.
La adquisición natural de H. pylori
ocurre con frecuencia en la infancia y una vez que se establece, la
infección persiste durante toda la vida, aunque también
se ha descrito su eliminación natural. Se considera que su
adquisición es por contacto interpersonal, aunque el contacto
con animales o con agua contaminada también se han considerado
ocasionalmente como fuentes potenciales de infección.
2.
CONSIDERACIONES CLÍNICAS
Cuando H. pylori coloniza la mucosa gástrica
humana produce una gastritis superficial que puede permanecer así
durante el resto de la vida o bien, al cabo de años o décadas
desarrollar un úlcera péptica (duodenal o gástrica)
o una gastritis atrófica que podría ser el primer paso
para la evolución a cáncer gástrico. También
puede desarrollarse un tipo de linfoma, poco frecuente, que es el
linfoma gástrico tipo MALT (mucosa associated lymphoid
tissue).
Todavía no se conoce claramente por qué
en unos pacientes la enfermedad es casi asintomática mientras
que en otros se producen enfermedades digestivas de diferente
gravedad. Existen factores genéticos predisponentes en el
paciente, como el grupo sanguíneo, el tipo de antígeno
Lewis o el tipo de HLA. También existen factores ambientales
como las condiciones socioeconómicas, el consumo de tabaco o la
dieta (la ingestión de sal actúa como factor agresivo de
la mucosa mientras que el consumo de alimentos anti-oxidantes actúa
como factor protector), que pueden influir en el desarrollo de un tipo
u otro de enfermedad. Por otro lado, los factores de patogenicidad de
la propia bacteria pueden tener su efecto en el desarrollo de la
enfermedad.
2.1. GASTRITIS
La gastritis que se origina después de la infección
por H. pylori puede desarrollarse sin manifestaciones o bien
originar la expresión clínica propia de gastritis aguda
(dolor epigástrico, naúseas y vómitos). La
gastritis aguda por H. pylori es un diagnóstico poco
frecuente y cuando se ha descrito ha sido tras ingestión
accidental o en voluntarios. Su curso es de 7 a 10 días y puede
evolucionar a la eliminación espontánea de H. pylori
o, más frecuentemente, a su cronicidad.
La gastritis crónica se caracteriza por
infiltración inflamatoria crónica, constituida por
linfocitos y células plasmáticas, con presencia de folículos
linfoides y un grado variable de actividad (infiltración
inflamatoria aguda). La gastritis crónica por H. pylori
es un proceso dinámico que evoluciona hacia la atrofia que
afecta al antro y a la mucosa transicional y se extiende en dirección
al cuerpo. También se puede asociar a metaplasia intestinal
como respuesta a la agresión crónica. En áreas
metaplásicas no se detecta H. pylori y la inflamación
es menor que en las no metaplásicas. La atrofia y la metaplasia
son dos procesos diferentes que pueden presentarse de forma
independiente.
2.2. ÚLCERA PÉPTICA
La asociación de H. pylori con la úlcera
duodenal es clara ya que el 90-95% de los pacientes con úlcera
duodenal presentan este microorganismo y la úlcera cicatriza al
erradicar la bacteria. Con respecto a la úlcera gástrica
también existe una clara relación aunque sólo un
70% de este tipo de úlcera está asociado con la
presencia de H. pylori, debido a que el resto de ellas están
producidas por consumo de anti-inflamatorios no esteroides.
2.3. CÁNCER GÁSTRICO
En el año 1994 la Agencia Internacional para la
Investigación en Cáncer de la Organización
Mundial de la Salud (IARC) incluyó a H. pylori como
agente biológico carcinógeno para el hombre (categoría
1) basándose en evidencias epidemiológicas que le
asocian con cáncer gástrico.
Por otra parte el papel de H. pylori en el cáncer
gástrico también se comprende porque la gastritis crónica
es un factor de riesgo para el desarrollo de este tipo de cáncer.
Además, el 70% de los pacientes con cáncer gástrico
son positivos para H. pylori.
2.4. LINFOMA GÁSTRICO TIPO
MALT
El 90% de los pacientes con linfoma MALT son positivos para H.
pylori. Es un tipo de linfoma que se localiza preferentemente en
el antro del estómago, dado que es la zona donde existe más
tejido linfoide. Además, varios estudios apoyan la asociación
de H. pylori con esta enfermedad puesto que tras la erradicación
de la bacteria se ha observado la regresión del linfoma.
2.5. MANIFESTACIONES
EXTRADIGESTIVAS
Se ha intentado asociar la infección por H. pylori
con diferentes enfermedades no digestivas como cardiovasculares
(aterosclerosis, cefalea primaria, fenómeno de Raynaud
primario), de piel (rosacea, alopecia areata, urticaria idiopática
crónica), autoinmunes (Síndrome de Sjögren,
neuropatía isquémica óptica anterior no arterítica),
hepáticas (encefalopatía hepática) y
respiratorias (bronquitis crónica, asma bronquial, cáncer
de pulmón).
3.
TRATAMIENTO
3.1. INDICACIONES DE TRATAMIENTO
En los últimos años se han realizado
diferentes reuniones de consenso sobre la infección por H.
pylori. Entre ellas destacan la del Instituto Nacional de Salud de
EE.UU. por ser el primero que recomendó el tratamiento
erradicador en pacientes infectados por H. pylori y úlcera
duodenal, pero también las que se realizaron en Canadá
en 1997 y 1999, el Consenso Asiático (Asia Pacific Consensus
Conference, 1999), el Consenso Latino-americano (2000), el Consenso
Europeo (Europeo: Maastrich Consensus, 1997 y 2000), y el Consenso
Español (1999).
- El Consenso de Maastrich del año 2000 considera que existe
una indicación clara de tratamiento en el caso de:
- (a) enfermedad ulcerosa péptica: duodenal activa o
cicatrizada, gástrica o complicada,
- (b) linfoma MALT de bajo grado,
- (c) gastritis atrófica,
- (d) resección después de cáncer gástrico.
- El Consenso Español realizado en 1999 recomienda también
tratamiento en la duodenitis erosiva y el de Maastrich considera una
indicación clara para diagnosticar y tratar:
- (a) los familiares en primer grado de pacientes con cáncer
gástrico,
- (b) por deseo del paciente.
Sería una indicación posible de
tratamiento los pacientes con dispepsia funcional, con enfermedad por
reflujo gastroesofágico o los pacientes que toman AINEs aunque
estos temas son más discutibles.
3.2. PAUTAS DE TRATAMIENTO
Las pautas de tratamiento para erradicar H. pylori
combinan 2 o 3 antimicrobianos junto con un compuesto anti-ulceroso,
que permite modificar el pH para que actúe el antibiótico.
Numerosos antimicrobianos han demostrado actividad in vitro
frente a H. pylori. Sin embargo, cuando se han aplicado en
pautas de tratamiento han demostrado escasa actividad. Entre los
antimicrobianos que han mostrado buena utilidad clínica se
encuentran: amoxicilina, tetraciclina, metronidazol y claritromicina.
La furazolidona, rifabutina o las fluoroquinolonas son otras opciones
terapéuticas.
Entre los compuestos anti-ulcerosos se han utilizado
con preferencia inhibidores de la bomba de protones (IBP) (omeprazol,
lansoprazol, pantoprazol, rabeprazol, esomeprazol), seguido de
compuestos de bismuto (citrato de bismuto, salicilato de bismuto, RBC:
ranitidina citrato de bismuto) y en mucha menor frecuencia los
antagonistas de los receptores H2
(ranitidina, cimetidina, famotidina, etc).
La duración de la terapia habitual ha sido de
7 a 10 días, aunque algunos autores han probado pautas cortas,
de 3 a 5 días que incluyen 3 antibióticos y otros
recomiendan pautas largas, de más de 10 días.
Antes de iniciar una pauta de tratamiento se debe
considerar el porcentaje de resistencia a los antimicrobianos en esa
población o área geográfica. Se recomienda la
pauta de tratamiento triple con un IBP y dos antimicrobianos como
primera opción. Si este tratamiento falla, se debe evitar
repetir dos veces la misma pauta y recomienda realizar estudios
microbiológicos antes de iniciar una nueva pauta.
La primera pauta eficaz utilizada fue la "triple
clásica" que asocia un imidazol (metronidazol o tinidazol)
con tetraciclina y amoxicilina durante dos semanas. Ésta fue
sustituida por otras que combinan un IBP (normalmente omeprazol) con
dos antibióticos (fundamentalmente amoxicilina, claritromicina
y metronidazol). Son más fáciles y cómodas para
el paciente, logrando tasas de erradicación superiores al 90%.
La asociación de un IBP (generalmente omeprazol) con
claritromicina y amoxicilina (conocida como la OCA) es la pauta más
utilizada. También se puede utilizar una triple terapia con un
IBP, amoxicilina y metronidazol. Es preferible reservar la pauta que
incluye IBP con metronidazol y claritromicina como de segunda línea
para evitar que se pueda desarrollar resistencia a los dos
antimicrobianos.
La combinación de un IBP y dos antibióticos
con las sales de bismuto se conoce como "terapia cuádruple",
alcanza altas tasas de erradicación pero debe reservarse también
para cuando fallen otras terapias. Recientemente se han propuesto
pautas que asocian un IBP con fármacos como rifabutina o
levofloxacino y amoxicilina, aunque con ellas se tiene todavía
poca experiencia.
3.3. CAUSAS DE FRACASO DEL
TRATAMIENTO
En el fracaso del tratamiento pueden intervenir factores
relacionados con el mismo tratamiento, factores del paciente y
factores de las cepas. Entre los primeros podemos citar las dosis
inadecuadas, una duración incorrecta del tratamiento y el tipo
y la dosis del inhibidor de la bomba de protones utilizado. Entre los
factores del paciente destaca el cumplimiento del tratamiento (por el
elevado número de dosis, por los efectos secundarios, etc) y el
país donde se realizó el ensayo. Entre los factores del
microorganismo es muy importante la resistencia a los antibióticos
y quizá las características particulares de la cepa.
El desarrollo de resistencia a amoxicilina y
tetraciclina es poco frecuente. Sin embargo, la resistencia al
metronidazol es muy elevada en algunas poblaciones y a la
claritromicina está aumentando en diferentes poblaciones,
siendo un problema cada vez mayor. La infección por cepas
resistentes a claritromicina o a metronidazol supone una importante
contrariedad porque se relaciona con fallo del tratamiento.
4.
DIAGNÓSTICO
Para diagnosticar la infección por H. pylori se
pueden realizar métodos invasivos (requieren endoscopia con
toma de biopsia gástrica) o métodos no invasivos (no
requieren endoscopia previa).
A la hora de elegir uno u otro método hay que
tener en cuenta el objetivo del diagnóstico (epidemiológico,
diagnóstico o de seguimiento), el centro en el que nos
encontramos (experiencia del personal y disponibilidad de medios) y
las características del paciente (prevalencia de H. pylori
en la población, edad del paciente, medicación previa,
etc). No se debe olvidar que mientras que todos los métodos
pueden servir para diagnosticar la infección por H. pylori
(con diferentes porcentajes de sensibilidad y especificidad), la
endoscopia con toma de biopsia para estudio histológico permite
además diagnosticar el tipo de enfermedad. Por otra parte, el
cultivo es imprescindible para conocer la sensibilidad a los
antimicrobianos, con el fin de aplicar el tratamiento más
efectivo en cada paciente, pero también para conocer los
porcentajes de sensibilidad en cada población.
4.1. HISTOLOGÍA Y VISIÓN
MICROSCÓPICA
El estudio histológico de la biopsia permite conocer las
lesiones de la mucosa además de detectar la infección
por H. pylori. La confirmación histológica de la
inflamación de la mucosa es fundamental para el diagnóstico
de la gastritis y su clasificación. Además permite
detectar zonas de metaplasia intestinal. Revisaremos únicamente
las tinciones que se pueden realizar desde el punto de vista microbiológico
para diagnosticar la infección por H. pylori.
La técnica de tinción a partir de
biopsia gástrica es una técnica fácil, rápida,
de muy bajo coste y alta utilidad en el estudio de la infección
por el microorganismo. Se han utilizado diferentes tinciones como la
de Gram, Gram modificada o bien el examen en fresco utilizando un
microscopio con contraste de fases. Otras tinciones son útiles,
además de para determinar el diagnóstico de la infección,
para conocer el grado de patología gástrica. Entre ellas
destacan las tinciones de Giemsa, carbolfuchina, Genta, la tinción
triple de carbolfuchina/azul de Alcina/hematoxilina-eosina y tinciones
de inmunohistoquímica.
Se han hecho modificaciones sobre las tinciones
previamente descritas, como la realizada en nuestro laboratorio que
consiste en una tinción de Gram modificada, utilizando como
contracolorante carbolfuchina y dejándola actuar durante un
tiempo superior al habitual (de 2-5 minutos).
La visión microscópica tiene una
sensibilidad y especificidad menor que la del cultivo y para obtener
buenos resultados es necesario realizar una impronta densa en el
portaobjetos, lo cual se consigue bien impregnando intensamente la
biopsia a lo largo del mismo, bien colocando sobre el portaobjetos 2-3
gotas de la biopsia homogeneizada. Para conseguir una buena
sensibilidad se recomienda partir de dos biopsias, una de antro y otra
de cuerpo.
4.2. PRUEBA DE LA UREASA
4.2.1. Propósito
H. pylori posee una ureasa que le capacita para la
colonización y persistencia en la cavidad gástrica. Se
localiza tanto en la membrana externa como en el espacio periplásmico
y está compuesta por complejos de una estructura hexamérica.
Se ha comprobado que mutantes isogénicos carentes de la enzima
son incapaces de colonizar animales de experimentación. La
potencia de la ureasa es muy superior a la de otras bacterias,
incluida Proteus spp. La enzima cumple tres funciones
principales: protección frente al ácido de la mucosa gástrica,
provisión de nitrógeno en forma de amonio y como factor
de virulencia en la patogenia de la úlcera gástrica.
El fundamento de la prueba rápida de la
ureasa consiste en detectar la presencia de la enzima de la siguiente
forma: H. pylori descompone la urea en anhídrido carbónico
y amoniaco, lo cual genera un pH básico que va a ponerse en
evidencia mediante el cambio de color del medio de naranja-amarillo a
rosa fuerte debido a la acción del indicador de pH.
NH2-CO-NH2
-> CO2 + NH3
La prueba de la ureasa rápida se puede
realizar directamente con la muestra de biopsia gástrica,
obtenida mediante endoscopia digestiva alta. Se recomiendan dos
biopsias, una de cuerpo y otra de antro para el diagnóstico.
Las muestras pueden ser inoculadas en la misma sala de endoscopias por
lo que no necesitan ningún medio de transporte.
Existen diferentes reactivos comerciales dirigidos a
detectar la enzima a partir de biopsia. Todos ellos contienen urea a
diferentes concentraciones (se estima que hasta un máximo del
6% porque concentraciones superiores pueden inhibir la enzima) y un
indicador de pH y varían en el diseño de los mismos:
existen "test" de gelosa como Clotest®, HUTtest® y
Hpfast® en los que la muestra se introduce en un medio semisólido
que contiene los reactivos, "tests" de membrana, en los que
los reactivos están contenidos en una tira de papel, como
Pyloriteck® y Pronto Dry® y "tests" en medio líquido
como Helicochek®.
En general son sistemas comerciales muy sencillos de
utilizar y los resultados se interpretan en un intervalo corto de
tiempo (media hora), observando el cambio en el color del reactivo.
Los resultados de sensibilidad y especificidad son en general
superiores al 80% y 90%, respectivamente.
También se puede utilizar una solución
preparada en el laboratorio que contenga urea al 3-4% e indicador de
pH, sin embargo los resultados de sensibilidad pueden ser algo
menores. La solución se puede preparar con 60 g/L de urea,
0,012 g/L de rojo fenol, 2 g/L de KH2PO4,
1 g/L de peptona, 5 g/L de NaCl y 10 g/L de glucosa en agua destilada.
4.3. CULTIVO DE HELICOBACTER
PYLORI
El aislamiento mediante cultivo de H. pylori es sin duda
el método más especifico en el diagnóstico del
microorganismo. No obstante su sensibilidad varía notablemente
en relación con diferentes variables como la recogida,
transporte y almacenamiento de la muestra, los medios de cultivo
utilizados y las condiciones de incubación (porcentaje de CO2
y humedad, principalmente). Se puede considerar como un método
tedioso e incluso de difícil realización, pero debe
efectuarse de rutina si se realiza la endoscopia ya que aporta un gran
número de ventajas en el estudio de la bacteria. Entre ellas
destaca el conocimiento de la sensibilidad a los diferentes
antimicrobianos, la caracterización de factores de virulencia y
la posibilidad del tipado de cepas con fines epidemiológicos.
4.3.1. Recogida de la
muestra
La muestra más habitual para el cultivo de H. pylori
es la biopsia a partir de mucosa gástrica. El microorganismo se
encuentra predominantemente en la parte antral del estómago,
excepto en individuos tratados con IBP y antihistamínicos
anti-H2,
en los que se encuentran densidades más grandes en el cuerpo.
Se encuentra, igualmente en mayor proporción en el antro gástrico
en comparación con duodeno incluso en pacientes con duodenitis.
Debido a la distribución parcheada se recomiendan varias
biopsias para el aislamiento. Para obtener resultados óptimos
se requieren cuatro biopsias, si bien se acepta de una manera general
y de acuerdo con la clasificación modificada de Sydney que para
asegurar un diagnóstico suficiente se deben procesar para
cultivo al menos una muestra de antro y, si es posible, dos de cuerpo.
Se han utilizado otras muestras gástricas
como jugo gástrico, la obtenida mediante la prueba del hilo ("string
test") y el aislamiento a partir de vómitos, aportando
diferentes resultados. H. pylori se ha cultivado puntualmente
también de muestras extragástricas como placa dental, esófago,
recto y vejiga urinaria.
Cualquier antibiótico con actividad frente a
H. pylori reducirá considerablemente el número
de bacterias en el estómago. Si el paciente ha estado en
tratamiento con antibióticos es necesario esperar al menos
cuatro semanas tras la última dosis para obtener resultados
satisfactorios en lo que respecta al cultivo.
Otro aspecto importante a tener en cuenta es la
limpieza de los fórceps con los que se realizan las biopsias.
Estos dispositivos deben desinfectarse adecuadamente para evitar
contaminaciones entre los pacientes, si bien si la desinfección
es demasiado fuerte puede perjudicar la viabilidad de la bacteria.
4.3.2. Transporte y
conservación de la muestra
H. pylori es un microorganismo lábil y el
procesamiento de la muestra debe realizarse de una forma rápida
una vez que esta ha sido obtenida.
Si el procesamiento es inmediato se debe introducir
la biopsia en un tubo estéril con 0,5 ml de suero salino, si
bien otros autores recomiendan dejar la muestra sobre la pared del
tubo sin introducirla en el suero. H. pylori permanece viable
en suero salino hasta 6 horas, de forma que si la siembra se realiza
con posterioridad, la biopsia debe introducirse en medio de transporte
semisólido para aumentar la viabilidad de la bacteria hasta 48
h si se conserva en nevera a 40C.
No obstante la mejor alternativa parece ser procesar
la biopsia durante las cuatro horas posteriores tras la recogida de la
muestra.
4.3.3. Procesamiento de la
muestra y medios de cultivo
Previa a la inoculación es conveniente realizar una
homogeneización de la biopsia bien mediante un mortero de
cristal o preferiblemente con un triturador eléctrico en un
volumen pequeño de suero fisiológico. El objetivo no es
romper completamente el tejido sino mejorar la liberación de
las bacterias de la superficie del mismo. Una vez realizada la
homogeneización de la muestra se deben colocar dos gotas del
homogeneizado en un medio selectivo y otras dos en otro no selectivo.
H. pylori es un microorganismo capaz de
crecer en distintos medios de cultivo si bien requiere diferentes
factores de crecimiento. Es difícil de cultivar en medio líquido
aunque se logra con menor dificultad a partir de caldo de Brucella,
cerebro-corazón, Mueller-Hinton y tripticasa soja, todos ellos
suplementados con nutrientes, siendo el más común el
suero bovino fetal.
Los medios de cultivo sólidos base más
frecuentes son agar Mueller-Hinton y agar Columbia y los suplementos más
comúnmente empleados son la sangre o derivados de ella. Otros
suplementos son el suero de caballo, lisado de eritrocitos y hemina,
extracto de levadura, peptona, e Isovitalex, si bien los resultados no
son mejores que los obtenidos con suero bovino fetal o sangre.
Recientemente se ha mostrado prometedor en el cultivo del
microorganismo un extracto obtenido de cianobacterias.
Dos aspectos importantes a considerar en relación
con la sangre son, en primer lugar la cantidad utilizada, ya que un
aumento en la proporción al 7-10% mejora significativamente el
crecimiento en comparación con el 5%. En segundo lugar el tipo
de sangre utilizada, encontrándose un crecimiento más
denso con sangre de caballo al 10% y lisada al 7%.
Con el objeto de evitar el sobrecrecimiento de
contaminantes que pueden acompañar a H. pylori en la
biopsia es necesaria la utilización de inhibidores que no
afecten su viabilidad. H. pylori es resistente in vitro
a la vancomicina, sulfametoxazol, trimetoprim, cefsulodina y
polimixina B, los cuales pueden utilizarse en los medios selectivos
para su aislamiento.
4.3.4. Condiciones de
incubación
H. pylori es un microorganismo microaerofílico que
requiere para su crecimiento una atmósfera con las siguientes
características: 5-10% de O2,
5-10% de CO2
y 80-90% de N2
a 35-37ºC, una humedad del 95% y una incubación de hasta
10 días antes de considerar negativo el cultivo. Estas
condiciones se obtienen bien utilizando cabinas de microaerofilia o
con sobres comerciales que proporcionen las características
anteriores. Estos últimos proporcionan resultados muy buenos
pero tienen como inconveniente la necesidad de reemplazar los sobres
una vez abiertas las jarras.
4.3.5. Criterios para
interpretación de resultados.
4.3.5.1. identificación del
microorganismo. La identificación se realiza mediante
visualización en fresco con un microscopio de contraste de
fases para ver la morfología o bien mediante una tinción
de Gram. Las pruebas positivas de catalasa, ureasa y oxidasa confirman
la identificación como H. pylori.
4.3.5.2. subcultivos y
conservación de las cepas. Una vez realizado el aislamiento
se debe subcultivar cada 48-72 horas en medios no selectivos en las
condiciones anteriormente expuestas. Las cepas se pueden conservar en
caldo tripticasa soja o infusión de cerebro corazón con
glicerol al 20% en congelador a –800C o en nitrógeno
líquido.
- 4.4. MÉTODOS MOLECULARES
En los últimos años se han desarrollado numerosas técnicas
que permiten detectar la presencia del ADN de H. pylori
directamente en la biopsia gástrica pero también en
otras muestras como heces, saliva o agua. La mayoría de las técnicas
se basan en la PCR, tanto clásica como en tiempo real. El
objetivo de todas ellas ha sido:
- -detección de genes específicos de la bacteria.
Permite detectar H. pylori en diferentes muestras. Se ha
utilizado el estudio del gen de la ureasa (ureA o ureC),
el gen 16S ARNr u otros genes,
- -detección de factores de virulencia. Aunque se han
realizado numerosos estudios actualmente no tienen una clara
aplicación práctica pues no se puede caracterizar a
una cepa como mas patógena con el fin de tratar o no, en base
a la presencia de estos genes de virulencia.
- -detección de mecanismos de resistencia (principalmente a
claritromicina, ver apartado 5).
4.5. PRUEBA DEL ALIENTO (UREA
BREATH TEST, UBT)
Es un método indirecto que se basa en la presencia de la
ureasa de H. pylori. El paciente ingiere una solución
con urea marcada isotópicamente con
13C
(no radioactivo) o 14C
(radioactivo) y se recoge el aliento 30 minutos después de la
ingestión de la solución de urea; previamente se habrá
recogido otra muestra de aliento basal. Si H. pylori se
encuentra en el estómago, éste hidroliza la urea gracias
a su ureasa y se libera CO2
marcado (13C
o 14C)
que se absorbe, difunde a sangre y transporta a los pulmones y es
liberado con el aliento.
Los resultados se miden como la relación de
13C
o 14C/12C
de la prueba con respecto al estándar. Tanto el sistema
radiactivo como el no radiactivo presentan similares porcentajes de
sensibilidad aunque generalmente se prefiere el no radiactivo si se
dispone del espectrómetro de masas.
Estas pruebas tienen una excelente sensibilidad y
especificidad para el diagnóstico y seguimiento del tratamiento
antimicrobiano con la ventaja de ser una prueba global que valora la
presencia de H. pylori en el estómago y no se ve
sometido al sesgo que pueden tener otras pruebas por la distribución
parcheada de la bacteria en el estómago. También tienen
otras ventajas, como el ser una prueba no invasora y no depender de
las condiciones de transporte, ni de la experiencia del personal técnico.
La prueba del aliento indica una infección actual por la
bacteria ya que en una infección pasada el resultado sería
negativo. Por esto es útil como seguimiento del tratamiento
realizado 4 a 6 semanas después de finalizado.
Recientemente, se está utilizando un nuevo
analizador con espectrometría de infrarrojos que permite la
realización de la técnica en la consulta del clínico
en pocos minutos.
4.6. SEROLOGÍA
4.6.1. Características de los métodos
serológicos
Los métodos serológicos se basan en la detección
de anticuerpos específicos frente a H. pylori en suero,
saliva u orina. La serología es útil en el estudio de
poblaciones seleccionadas, sin embargo, su principal problema radica
en que no puede diferenciar la infección activa de la exposición
previa al microorganismo. El rendimiento de las pruebas serológicas
puede verse afectado por el método diagnóstico
considerado como referencia (gold estándar), la clase
de anticuerpo, el tipo de antígeno y la técnica serológica
utilizada, así como por la población estudiada.
H. pylori provoca una respuesta inmunitaria,
tanto local como sistémica. El sistema inmune responde con un
aumento transitorio de IgM, seguido de un aumento de anticuerpos de
los tipos IgG e IgA que persisten durante la infección. Puesto
que los anticuerpos IgM se detectan sólo transitoriamente,
tienen poco valor para el diagnóstico. La principal respuesta
sistémica es de tipo IgG por lo que la detección de
estos anticuerpos es la más utilizada para el diagnóstico.
La prevalencia de anticuerpos tipo IgG en adultos
sanos en España es alta, por lo que su detección en el
diagnóstico de la infección por H. pylori
origina un elevado porcentaje de falsos positivos y por tanto, hacen
falta técnicas complementarias para llegar a un diagnóstico
correcto. Un meta-análisis de 21 sistemas comerciales de
detección de IgG mostró una sensibilidad del 85% y una
especificidad del 79%. En cuanto al valor diagnóstico de la
IgA, existen discrepancias entre los autores y no parece añadir
mayor eficacia a la determinación de anticuerpos IgG.
Se han utilizado varias clases de antígenos,
que van desde células enteras o sonicadas hasta antígenos
parcial o altamente purificados (ureasa, etc.). La detección de
anticuerpos específicos contra algunas proteínas del
microorganismo, como CagA y VacA puede tener especial interés
en estudios sobre virulencia. Puesto que la detección de
anticuerpos depende del antígeno utilizado, considerando la
heterogeneidad genética de H. pylori y las variaciones
geográficas, algunos autores recomiendan el uso de mezclas de
antígenos procedentes de varias cepas para mejorar la
sensibilidad de estas técnicas así como su valoración
en cada medio.
La técnica más utilizada es el EIA
cuantitativo, que permite, además del diagnóstico
primario, la monitorización del tratamiento. Los métodos
serológicos cualitativos muestran peores resultados y los métodos
rápidos no se recomiendan. Las técnicas que detectan
anticuerpos en saliva y en orina son atractivas, ya que estas muestras
son fáciles de obtener, pero en ellas, la concentración
de anticuerpos es más baja que en suero. Los resultados
prometedores de algunos trabajos no se han confirmado en estudios
multicéntricos por lo que no se recomiendan en el diagnóstico.
Los métodos basados en la técnica del
Western Blot se utilizan para el estudio de la respuesta frente a antígenos
concretos, como CagA y VacA.
4.6.2. Utilidad clínica
Mientras los estudios serológicos son de indudable valor
para conocer la epidemiología de este patógeno, su valor
en el diagnóstico debe interpretarse con cautela ya que existe
una elevada seroprevalencia en poblaciones sanas, por lo que en
nuestro medio, los resultados positivos para adultos pueden ser no
concluyentes.
Una importante ventaja de los métodos serológicos,
es que sus resultados no se ven afectados por el tratamiento reciente
con antibióticos o inhibidores de la bomba de protones, que
pueden inducir falsos negativos con otros métodos.
El Grupo de Consenso Europeo para el Estudio de Helicobacter
recomienda la realización de técnicas serológicas
en el ámbito de atención primaria, en pacientes menores
de 45 años con síntomas de dispepsia y sin signos de "alarma"
(anemia, pérdida de peso, etc.). En atención
especializada, no existe consenso sobre la utilidad de la serología
como método de filtrado preendoscópico.
En menores de 12 años, la sensibilidad de la
serología es demasiado baja para utilizarse como cribado.
Puesto que la especificidad está entorno al 90%, un resultado
positivo podría considerarse diagnóstico de infección
por H. pylori en este grupo de pacientes.
En caso de hemorragia digestiva, la serología
es una de las técnicas más sensibles, pero también
plantea problemas de especificidad y de bajo valor predictivo
negativo, por lo que no debe emplearse como único método
diagnóstico de la infección por H. pylori en
caso de úlcera péptica sangrante.
En la monitorización de la respuesta al
tratamiento, y debido al lento descenso del título de
anticuerpos (3-6 meses) no es ésta la técnica de elección,
sin embargo, varios estudios han mostrado que los EIA cuantitativos
pueden ser útiles en algunos casos.
La eficacia de la serología en el seguimiento
de la respuesta al tratamiento se relaciona directamente con el nivel
de anticuerpos pretratamiento y el tiempo de seguimiento entre las
muestras pre y postratamiento. Se recomienda realizar pruebas
cuantitativas con los dos sueros del paciente (pre y postratamiento)
analizados simultáneamente. En pacientes con altos títulos
pretratamiento se observa un descenso significativo en el título
de anticuerpos después de 3-6 meses de tratamiento efectivo.
Este descenso de anticuerpos sólo se mantiene en pacientes
curados.
Existen diferentes métodos comerciales que se
basan fundamentalmente en la detección de IgG mediante ELISA.
Son muy útiles para la realización de estudios epidemiológicos.
Cada uno de los métodos tiene distinta sensibilidad y
especificidad.
4.6.3. Recogida de la
muestra
Las técnicas serológicas se realizan con una
muestra de suero que se debe recoger y procesar de acuerdo con la
normas microbiológicas habituales (Recogida, transporte y
procesamiento general de muestras en el laboratorio de Microbiología,
PNT-RTP-01, SEIMC 2003).
4.6.4. Transporte y
conservación de la muestra
Las muestras de suero deben transportarse y conservarse según
la normativa habitual (Recogida, transporte y procesamiento general de
muestras en el laboratorio de Microbiología, PNT-RTP-01, SEIMC
2003).
4.6.5. Procesamiento de la
muestra
Las muestras de suero deben procesarse según la normativa
habitual (Recogida, transporte y procesamiento general de muestras en
el laboratorio de Microbiología, PNT-RTP-01, SEIMC 2003).
4.6.6. Criterios para
interpretación de resultados
Los criterios de interpretación de los resultados dependen
de cada uno de los equipos comerciales y por lo tanto es necesario
seguir rigurosamente las recomendaciones de cada fabricante.
4.7. ANTÍGENO EN HECES
4.7.1. Características de la técnica
Es un método directo no invasivo que permite la detección
de antígeno de H. pylori en muestras de heces. Existen
varios sistemas comerciales que permiten detectar la presencia de antígeno
en heces con anticuerpos policlonales o monoclonales y pueden existir
pequeñas diferencias entre ellos.
Se ha descrito como válida para establecer el
diagnóstico inicial, verificar la eficacia del tratamiento en
las cuatro o seis semanas posteriores a su realización y
comprobar la reaparición de una infección. Se trata de
un ensayo cualitativo (no cuantitativo). La técnica aporta una
información muy valiosa por la fácil obtención y
conservación de las muestras, se puede realizar en cualquier
laboratorio de microbiología y no necesita la colaboración
del paciente (como en el caso de la prueba del aliento). Es muy útil
en niños pequeños. Puede utilizarse tanto para el diagnóstico
de colonización por H. pylori como para el seguimiento
después del tratamiento erradicador.
El primer equipo comercializado fue el Premier
Platinum HpSA (Meridian diagnostics) consiste en una técnica de
enzimoinmunoanálisis preparado con anticuerpos policlonales
anti-H. pylori. Presenta excelente especificidad pero existen
datos variables de sensibilidad (de 57,7% a 96,6% según los
estudios).
El equipo FemtoLab (Connex, Munich, Germany) también
comercializado con el nombre Amplified-IDEAa-HpSTAR (Dako, Glostrup,
Denmark) consiste en una técnica de enzimoinmunoanálisis
realizado con anticuerpos monoclonales anti-H. pylori que
presenta mejores resultados de sensibilidad (de 88 a 98% según
los estudios).
Recientemente se ha desarrollado un sistema de
inmunocromatografía ImmunoCard STAT HpSA (Meridian Diagnostics)
realizado con anticuerpos monoclonales que presenta valores de
sensibilidad de 73 a 96% aunque todavía está poco
estudiado.
Por lo tanto, en función de los estudios
actualmente disponibles, el sistema más recomendable es el
sistema de EIA con anticuerpos monoclonales por sus mejores resultados
en cuanto a sensibilidad de la técnica y por la buena
reproducibilidad.
4.7.2. Recogida de la
muestra
La muestra para detección de antígeno es una
muestra de heces que debe recogerse y conservarse según la
normativa habitual (Recogida, transporte y procesamiento general de
muestras en el laboratorio de Microbiología, PNT-RTP-01, SEIMC
2003).
4.7.3. Transporte y
conservación de la muestra
Las muestras de heces deben transportarse y conservarse según
la normativa habitual (Recogida, transporte y procesamiento general de
muestras en el laboratorio de Microbiología, PNT-RTP-01, SEIMC
2003).
4.7.4. Procesamiento de la
muestra
Las muestras de heces deben procesarse según la normativa
habitual (Recogida, transporte y procesamiento general de muestras en
el laboratorio de Microbiología, PNT-RTP-01, SEIMC 2003).
4.7.5. Criterios para
interpretación de resultados
Los criterios de interpretación de los resultados varían
según los equipos comerciales y por lo tanto es necesario
seguir rigurosamente las recomendaciones de cada fabricante.
5.
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS
La determinación de la sensibilidad in vitro de
H. pylori a los agentes antimicrobianos es importante ya que
la resistencia primaria o adquirida a varios antibióticos se
asocia con la ausencia de erradicación de la bacteria en el estómago.
Actualmente existe una recomendación del Nacional
Committee for Clinical laboratory Standards (NCCLS) que aconseja
el método de dilución en agar y establece puntos de
corte para claritromicina. Sin embargo, la British Society for
Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) recomienda difusión con
E-test. Por último, la difusión con disco también
se ha utilizado por diferentes autores.
- 5.1 DILUCIÓN EN AGAR
Es el método de referencia pero no aplicable de forma
rutinaria para cada cepa aunque es válido para confirmar los
resultados obtenidos por otros métodos y realizar estudios con
el objeto de conocer la tasa global de resistencia en un área
determinada. La metodología que recomienda el NCCLS es la
siguiente:
- -Medio: Mueller-Hinton agar suplementado con 5% de sangre de
carnero (de más de 2 semanas).
- -Inóculo: Preparar un 2 de MacFarland (1x107
a 1x108
ufc/mL) en solución salina a partir de un subcultivo de 72
horas de H. pylori en agar sangre.
- -Incubación: 3 días en atmósfera microaerofílica
producida con sobre generador de gas válido para Campylobacter.
- -Se debe utilizar la cepa control H. pylori ATCC 43504
para la que existen límites aceptables de valor de CMI de:
amoxicilina (0,016-0,12 mg/L), claritromicina (0,016-0,12 mg/L),
metronidazol (64-256 mg/L), telitromicina (0,06-0,5 mg/L) y
tetraciclina (0,12-1,0 mg/L).
- -El punto de corte de resistencia a claritromicina se recoge en
la tabla 1, considerando que el antibiótico se utiliza en una
de las pautas aprobadas por la FDA junto con un inhibidor de la
bomba de protones o ranitidina-citrato de bismuto.
- 5.2. DIFUSIÓN CON E-TEST
Es un método cuantitativo para realizar las pruebas de
sensibilidad in vitro basado en la difusión. El método
del epsilómetro está especialmente recomendado en
organismos exigentes y cuando se deben probar pocos microorganismos o
pocos antibióticos. Tiene diferentes ventajas sobre los métodos
tradicionales de dilución en agar, dilución en caldo o
difusión en agar. La correlación de este método
con la dilución en agar no es buena cuando se estudia
metronidazol. La British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC)
recomienda:
- Medio de cultivo: Mueller-Hinton o Wilkins-Chalgren suplementado
con 5-10% de sangre de caballo.
- Inóculo: resuspender colonias de un cultivo de 2 a 3 días
de incubación en agua destilada estéril y ajustar a un
3 de McFarland, e inocular la superficie de una placa con una
torunda empapada en esta suspensión. Aplicar la tira de
E-test después de dejar que se seque el inóculo
aplicado.
- Incubación: a 35ºC en microaerofília durante 3
a 5 días y leer la CMI como el punto en el que existe una
inhibición completa del microorganismo.
- Los puntos de corte de resistencia se muestran en la tabla 1.
Tabla 1. Puntos de corte recomendados por la
NCCLS o por la BSAC.
| |
NCCLS |
BSAC |
|
Método |
Dilución en agar |
E-test |
| |
Punto corte (mg/L) |
Punto corte (mg/L) |
| |
S |
I |
R |
S |
R |
|
Amoxicilina |
|
|
|
<1 |
>2 |
|
Claritromicina |
<0.25 |
0.5 |
>1 |
<1 |
>2 |
|
Tetraciclina |
|
|
|
<2 |
>4 |
|
Metronidazol |
|
|
|
<4 |
>8 |
- 5.3. DIFUSIÓN CON DISCOS
Es el método más fácil y barato para
determinar la sensibilidad in vitro, pero no hay muchos
estudios de correlación entre los valores de CMI y los diámetros
de inhibición en el caso de H. pylori, por lo que no es
el método más adecuado. Teniendo en cuenta que el método
de dilución en agar no es aplicable de rutina y el método
del E-test es caro y que también se observan discrepancias con
metronidazol, McNulty en 2002 realizó una revisión de
los estudios en los que se había utilizado difusión con
disco, recomendando:
- Medio de cultivo: Mueller-Hinton o Columbia suplementado con 5 a
10% de sangre (de caballo o carnero).
- Inóculo: preparar un inóculo de un 4 de McFarland
(108 ufc/mL) a partir de un cultivo de menos de 4 días
de incubación.
- Concentración de discos y puntos de corte: para
metronidazol recomienda utilizar un disco de 5 µg y considera
resistente si el halo es <16 mm, intermedio si 16-21 mm y
sensible si >21 mm. En las cepas con sensibilidad intermedia se
recomienda la realización de un método de determinación
de CMI. Para claritromicina es preferible la utilización de
un disco de 2 µg considerando resistente cuando no existe halo
de inhibición. También se puede utilizar un disco de
15 µg de claritromicina y considerar resistente si el halo es
de <18 mm.
5.4 TÉCNICAS MOLECULARES
La resistencia a la claritromicina se produce por una mutación
puntual en el ARN ribosomal 23S en la posición 2142 (cambio de
adenina por guanina o citosina) o en la posición 2143 (cambio
de adenina por guanina). Se han desarrollado diversas técnicas
moleculares para detectar esta resistencia, que se han utilizado en
cepas cultivadas in vitro pero también directamente en
muestras de biopsia gástrica.
La detección de las mutaciones que confieren
resistencia a claritromicina en H. pylori se ha realizado
mediante PCR. Se amplifica un fragmento de 1,4 Kpb correspondiente al
dominio V de la región 23S del ARNr y se detecta la mutación
en A2142G y A2143G tras digestión con las enzimas MboII
y BsaI, respectivamente.
También se han utilizado técnicas de
secuenciación, de PCR "mismatcheada", de PCR y ensayo
de unión con oligonucleótido (PCR-OLA) y de hibridación
tanto en fase sólida (LiPA) como en líquida.
Recientemente se ha utilizado con éxito la PCR en tiempo real;
esta última permite detectar cualquier tipo de mutación
en la región de la sonda y el proceso se realiza en 1 hora.
La ventaja de las técnicas moleculares es la
rapidez en obtener resultados y la excelente correlación con la
sensibilidad obtenida por métodos fenotípicos. La
principal desventaja es que sólo sirve para detectar
resistencia a macrólidos y que se requiere disponibilidad de
este tipo de técnicas en el laboratorio.
- 6. BIBLIOGRAFÍA
- GENERAL
- 1.Asaka M, Dragosics BA. Helicobacter
pylori and gastric malignancies. Helicobacter 2004;
9:35-41.
- 2.Glupczynski Y. Diagnóstico
microbiológico de la infección por Helicobacter
pylori. En Helicobacter pylori: retos para el siglo XXI.
Microbiología, clínica y tratamiento. Manuel López-Brea
(editor). Prous Science, Barcelona 1999, pp. 41-54.
- 3.Makristathis A, Hirschl AM, Lehours P,
Megraud F. Diagnosis of Helicobacter pylori infection. Helicobacter
2004; 9:7-14.
- 4.Malfertheiner P, Megraud F, O,Morain C,
et al. The European Helicobacter pylori Study Group (EHPGS).
Current concepts in the management of Helicobacter pylori
infection. The Maastrich 2-2000 Consensus report. Aliment Pharmacol
Ther 2002; 16:167-180.
- 5.Megraud F, Lamouliatte H. The treatment
of refractory Helicobacter pylori infection. Aliment
Pharmacol Ther 2003; 17:1333-1343.
- 6.NIH Consensus
Conference. Helicobacter pylori in peptic ulcer disease. NIH
Consensus Development Panel on Helicobacter pylori in peptic
ulcer disease. JAMA 1994; 272:65-69.
- 7.Sainz R, Borda F, Dominguez E, Gisbert
JP. Helicobacter pylori infection. The Spanish consensus
report. The Spanish Consensus Conference Group. Rev Esp Dig 1999;
91:777-784.
- 8.Versalovic J, Fox JG. Helicobacter.
En: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH. Manual
of Clinical Microbiology (8 Ed). ASM Press Washington, 2003 pp.
915-928.
- ESPECÍFICA
- Ureasa rápida
- 1.Laine L, Lewin D, Naritoku W, Estrada R,
Cohen H. Prospective comparison of commercially available rapid
urease tests for the diagnosis of Helicobacter pylori. Gastrointest
Endosc 1996; 44:523-526.
- 2.Morio O, Rioux-Leclercq N, Pagenault M,
Corbinais S, Ramee MP, Gosselin M, Bretagne JF. Prospective
evaluation of a new rapid urease test (Pronto Dry) for the diagnosis
of Helicobacter pylori infection. Gastroenterol Clin Biol
2004; 28:569-573.
- Cultivo
- 1.Fresnadillo Martínez MJ, Rodríguez
Rincón M, Blázquez de Castro AM, García Sánchez
E, García Sánchez JE, Trujillano Martín I,
Cordero Sánchez M, Alvarez Alvarez P, Paz Bouza J, García-Rodríguez
JA. Comparative evaluation of selective and nonselective media for
primary isolation of Helicobacter pylori from gastric
biopsies. Helicobacter 1997; 2:36-39.
- 2.Ndip RN, MacKay WG, Farthing MJ, Weaver
LT. Culturing Helicobacter pylori from clinical specimens:
review of microbiologic methods. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2003;
36:616-622.
- Serología
- 1.Herbrink P, Van Doorn LJ. Serological
methods for diagnosis of H. pylori infection and monitoring
of eradication therapy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000;
19:164-173.
- 2.Vakil N, Vaira D. Non-invasive tests for
the diagnosis of H. pylori infection. Rev Gastroenterol Dis
2004; 4:1-6.
- Antígeno en heces
- 1.Andrews J, Marsden B, Brown D, Wong VS,
Wood E, Kelsey M. Comparison of three stool antigen tests for Helicobacter
pylori detection. J Clin Pathol 2001; 56: 769-771.
- 2.Koletzko S, Konstantopoulos N, Bosman D,
Feydt-Schmidt A, van der Ende A, Kalach N, Raymond J, Russmann H.
Evaluation of a novel monoclonal enzyme immunoassay for detection of
Helicobacter pylori antigen in stool from children. Gut
2003; 52: 804-806.
- Sensibilidad
- 1.Domingo D, Alarcón T. Mecanismo
de resistencia a antibióticos en Helicobacter pylori.
En Helicobacter pylori: retos para el siglo XXI. Microbiología,
clínica y tratamiento. Manuel López-Brea (editor).
Prous Science, Barcelona 1999, pp. 307-325.
- 2.Lascols C, Lamarque D, Costa JM,
Copie-Bergman C, Le Glaunec JM, Deforges L, Soussy CJ, Petit JC,
Delchier JC, Tankovic J. Fast and accurate quantitative detection of
Helicobacter pylori and identification of clarithromycin
resistance mutations in H. pylori isolates from gastric
biopsy specimens by real-time PCR. J Clin Microbiol 2003;
41:4573-4577.
- 3.López-Brea M, Alarcón T.
Sensibilidad a los antimicrobianos en la infección por Helicobacter
pylori. En Helicobacter pylori: retos para el siglo XXI.
Microbiología, clínica y tratamiento. Manuel López-Brea
(editor). Prous Science, Barcelona 1999, pp. 281-305.
- 4.McNulty C and the PHLS Helicobacter
Working Group. Helicobacter pylori susceptibility testing by
disc diffusion. J Antimicrob Chemother 2002; 49:601-609.
- 5.NCCLS. 2004. Performance
standards for antimicrobial susceptibility testing. 14th
informational supplement. NCCLS document M100-S14 (M7). NCCLS,
Wayne, Pa.
- 6.Versalovic J, Osato MS, Spakovsky K,
Dore MP, Reddy R, Stone GG, Shortridge D, Flamm RK, Tanaka SK,
Graham DY. Point mutations in the 23S rRNA gene of Helicobacter
pylori associated with different levels of clarithromycin
resistance. J. Antimicrob. Chemother 1997; 40:283-286.
|
rocedimientos
en Microbiología Clínica