| 20.
Diagnóstico microbiológico y control de la
legionelosis. 2005 |
| Coordinador: |
Carmen Pelaz
Antolín |
| Autores: |
Vicente Ausina |
|
Vicente Catalán |
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Emilia Cercenado |
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Carmen Pelaz
Antolín |
|
DOCUMENTO
CIENTÍFICO
- 1. INTRODUCCIÓN
La familia Legionellaceae incluye un género, Legionella,
que a su vez engloba 48 especies y más de 70 serogrupos. Más
de la mitad de las especies han causado patología en el hombre,
pero Legionella pneumophila origina más del 90% de las
infecciones. L. pneumophila comprende 16 serogrupos, siendo el
serogrupo 1 el más frecuentemente aislado en pacientes (más
del 80 % de los casos confirmados).
- Legionella es un bacilo gramnegativo ampliamente
distribuido en ambientes acuáticos naturales y artificiales, y
además, es un parásito intracelular de amebas y otros
protozoos de agua dulce, en los que utiliza un mecanismo de
multiplicación intracelular similar al usado en las células
del organismo humano. La enfermedad se produce cuando individuos
susceptibles inhalan la bacteria contenida en aerosoles procedentes de
una fuente ambiental contaminada.
- 2. MANIFESTACIONES
CLÍNICAS Y TRATAMIENTO
- La legionelosis puede tener dos presentaciones clínicas
diferentes: la enfermedad del legionario y la Fiebre de Pontiac. En la
primera, la enfermedad suele manifestarse como una neumonía,
aunque el espectro clínico puede variar desde una enfermedad
leve-moderada hasta la enfermedad grave con fallo multiorgánico.
La Fiebre de Pontiac, es una enfermedad autolimitada que da lugar a un
cuadro clínico similar al de la gripe.
- La neumonía causada por Legionella es clínicamente
indistinguible de otras neumonías y se caracteriza por un período
de incubación que oscila entre 2 y 10 días, aunque este
periodo podría ser algo mayor. El comienzo de la enfermedad
suele ser abrupto, con fiebre alta, malestar general, debilidad,
mialgias, dolor de cabeza y tos inicialmente no productiva, y
frecuentemente requiere hospitalización. El patrón
radiológico también es similar al de otras neumonías,
siendo común el infiltrado alveolar. Por tanto, el diagnóstico
de la enfermedad debe realizarse por métodos microbiológicos.
Las manifestaciones extrapulmonares generalmente incluyen confusión,
diarrea y dolor pleural, a veces los primeros síntomas son
diarrea, dolor muscular y moderada cefalea. La enfermedad puede llegar
a cursar con confusión mental e insuficiencia respiratoria y
renal.
- El tratamiento de los pacientes con antimicrobianos, generalmente
macrólidos o quinolonas, es eficaz, y en pacientes
hospitalizados con neumonía comunitaria el tratamiento empírico
debería incluir fármacos eficaces frente a L.
pneumophila, ya que el retraso en la aplicación de un
tratamiento adecuado se ha asociado con un aumento de la mortalidad de
la enfermedad.
- 3. EPIDEMIOLOGÍA
Los datos sobre la incidencia de la neumonía por L.
pneumophila son variables, suponiendo del 2 al 15 % de las neumonías
comunitarias que requieren hospitalización. Estas diferencias
parecen depender del lugar geográfico y del grupo de pacientes
investigados, habiéndose observado también fluctuaciones
temporales. Es más frecuente en personas entre 40 y 70 años,
aunque cada vez se detectan más casos en personas más jóvenes.
Es dos a tres veces más frecuente en varones que en mujeres y
es rara en niños. El riesgo de contraer la enfermedad depende
del estado de salud de las personas afectadas, aumentando el riesgo en
inmunodeprimidos, diabéticos, pacientes con enfermedad pulmonar
obstructiva crónica, en personas de edad avanzada, así
como en fumadores y alcohólicos.
- La legionelosis puede adquirirse en el hospital y en la
comunidad. Dentro de la legionelosis hospitalaria se pueden definir
los casos en tres niveles según el grado de información
epidemiológica y microbiológica: (i) Brote cuando se
producen dos o más casos relacionados epidemiológicamente
en el mismo hospital. (ii) Casos agrupados cuando éstos se
producen sin coincidir en el tiempo. (iii) Casos esporádicos
cuando éstos se producen de forma aislada en el tiempo. En la
comunidad, también se puede presentar la enfermedad en forma de
brotes, casos agrupados (asociados a la misma instalación o
edificio sin coincidir en el tiempo) y casos esporádicos, y la
adquisición de la enfermedad puede estar asociada a
instalaciones de varios tipos de edificios, incluyendo los hoteles.
- En los últimos años se ha producido un notable
incremento del diagnóstico de casos y brotes de legionelosis,
tanto en nuestro país, como en el resto del mundo. Sin embargo,
la precocidad en el diagnóstico, debido a la utilización
de pruebas de detección de antígeno en orina, ha
determinado una disminución de la mortalidad de la enfermedad.
- En España, la legionelosis es una enfermedad de declaración
obligatoria desde 1995 (Real Decreto 2210/1995 de 28 de diciembre).
Los casos y los brotes de legionelosis identificados en el Estado español
se declaran desde los Servicios de Vigilancia Epidemiológica de
las Comunidades Autónomas al Centro Nacional de Epidemiología,
a través de la Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica.
La información sobre el número de casos diagnosticados
se completa con datos del estudio epidemiológico relacionado
con su aparición, tanto en el ámbito comunitario como en
el nosocomial. El número de casos y brotes notificado a la
mencionada Red ha sufrido una tendencia creciente en nuestro país.
En 2000 se declararon 752 casos (tasa de 1,91 por 100.000 habitantes)
y en 2004 la cifra ascendió a 1.074 casos (2,62 por 100.000).
Los brotes declarados también aumentaron. En el quinquenio
2000-2004 se notificaron 184 brotes en los que resultaron afectadas
1.825 personas, mientras que en el quinquenio anterior (1994-1999) las
cifras fueron 43 brotes y 483 casos. Estos datos proceden del Centro
Nacional de Epidemiología.
- 4. ECOLOGÍA Y
TRANSMISIÓN DE LA BACTERIA
Legionella es una bacteria que se encuentra ampliamente
distribuida en los ecosistemas acuáticos de todo el mundo (como
ríos, lagos, fuentes termales, tierra húmeda y lodos,
agua de lluvia, etc.), donde es capaz de sobrevivir en un amplio rango
de condiciones físico-químicas. Sin embargo, la mayor
parte de los casos de legionelosis se asocian a ambientes acuáticos
creados o manipulados por el hombre, en los que la temperatura del
agua se encuentra por encima de la temperatura ambiente. Legionella
es una bacteria termotolerante, capaz de multiplicarse entre los 20 y
45ºC; puede sobrevivir entre los 40 y 60ºC, inactivándose
por encima de los 70ºC.
- La transmisión de Legionella es aérea y la
vía de entrada al organismo humano es a través del
sistema respiratorio, fundamentalmente mediante la inhalación
de aerosoles (dispersión de gotas de agua en el aire)
conteniendo la bacteria, generados por sistemas de agua contaminados.
En ocasiones se ha considerado la microaspiración de agua
contaminada para justificar algunos casos de legionelosis nosocomial.
No se ha demostrado la transmisión de la bacteria persona a
persona, ni se ha documentado la existencia de reservorios animales.
- El conocimiento del nicho ecológico de Legionella
proporciona una información de gran utilidad para entender la
transmisión de la bacteria, siendo este el primer paso para
abordar el control de su diseminación. Aunque Legionella
es una bacteria ampliamente distribuida en ambientes acuáticos,
su presencia en un sistema de agua no es suficiente para implicar a
una cepa como agente causal de infección. La aparición
de la enfermedad depende de una serie de requisitos encadenados que se
ven favorecidos por una serie de factores, como se detalla en la
Figura 1.
Figura 1. Requisitos y factores que
intervienen en la transmisión de Legionella (Adaptado
de en ASHRAE 2000)
- Por otra parte, Legionella consigue nutrientes en su hábitat
natural que son aportados por otros microorganismos: bacterias (Pseudomonas,
Acinetobacter, Flavobacterium, Alcaligenes), amebas, protozoos
ciliados y otros, que en el caso de los sistemas de agua, como cañerías,
acumuladores e interiores de las torres de refrigeración, se
hallan dentro de biocapas (biofilms) que recubren las superficies. Las
amebas y protozoos se consideran hospedadores naturales y
amplificadores de Legionella spp. Hasta ahora se conocen cinco
géneros de amebas (Acanthamoeba, Naegleria, Hartmanella,
Vahlkamphia y Echinamoeba) y un género de protozoo
(Tetrahymena) capaces de permitir el crecimiento intracelular
de L. pneumophila.
- Además, las biocapas integran algas (cianobacterias) que
se adhieren a las paredes de las conducciones y depósitos de
agua. La formación de biocapas se ve favorecida por el
estancamiento del agua, por la existencia de ramales o tramos ciegos
de uso infrecuente, por la disminución del flujo de agua, por
los materiales usados en la construcción de las cañerías
o de las bombas, y por la temperatura del agua. Las biocapas facilitan
el crecimiento de Legionella, y paralelamente la protegen
frente a la acción de los biocidas y las técnicas de
prevención aplicadas contra ella, como son el
hipercalentamiento o la hipercloración.
- En la literatura científica aparecen recogidas una
variedad de instalaciones relacionadas con casos/brotes de
legionelosis, como son la red de distribución de agua sanitaria
(caliente o fría), de edificios como hospitales y hoteles,
torres de refrigeración o condensadores evaporativos, equipos
de terapia respiratoria, piscinas climatizadas con movimiento de agua,
aguas termales en centros de rehabilitación y recreo, cruceros,
barcos, fuentes ornamentales, viviendas particulares, humidificadores,
máquinas productoras de hielo, unidades de transplantes y
unidades de odontología.
- 5. DIAGNÓSTICO
MICROBIOLÓGICO DE LAS INFECCIONES CAUSADAS POR Legionella
5.1. DEFINICIÓN DE CASO
- Según el protocolo recogido en la Red Nacional de
Vigilancia Epidemiológica, los casos de legionelosis se
clasifican en:
- 1) Caso confirmado: caso con clínica compatible y
confirmado con alguna de las siguientes pruebas de laboratorio:
- -Aislamiento de cualquier especie o serogrupo de Legionella
a partir de secreciones respiratorias, tejido pulmonar o sangre.
- -Seroconversión: aumento del título de anticuerpos
en 4 veces o más, en sueros tomados en la fase aguda y
convaleciente de la enfermedad, siempre que el título de la
segunda muestra sea > 128, frente a L. pneumophila
serogrupo 1, por inmunofluorescencia indirecta.
- -Demostración de antígeno de L. pneumophila
serogrupo 1 en orina.
- 2) Caso sospechoso o probable: caso con clínica compatible
y/o resultado positivo en alguna de las siguientes pruebas de
laboratorio consideradas presuntivas:
- -Título alto de anticuerpos (>256) frente a L.
pneumophila serogrupo 1 en suero tomado en fase convaleciente.
- -Seroconversión: aumento del título de anticuerpos
en 4 veces o más, en sueros tomados en la fase aguda y
convaleciente, siempre que el título de la segunda muestra
sea > 128, frente a cualquier especie o serogrupo de Legionella,
por inmunofluorescencia indirecta.
- -Observación microscópica de cualquier especie o
serogrupo de Legionella en extensiones de secreciones
respiratorias o tejido pulmonar por inmunofluorescencia directa,
utilizando anticuerpos policlonales o monoclonales marcados con
fluoresceína.
- La definición clínica de caso es la siguiente:
- -Enfermedad del legionario: enfermedad respiratoria aguda con
diarrea y vómitos. La mitad de los casos pueden presentar
signos focales de neumonía, fiebre alta, cefalea y mialgias y
una tercera parte confusión mental o delirio.
- -Fiebre de Pontiac: síndrome febril agudo y autolimitado.
- 5.2. CULTIVO E IDENTIFICACIÓN DE Legionella
El aislamiento de la bacteria en cultivo es el método de
referencia y proporciona un diagnóstico de confirmación
de la infección causada por Legionella. Es el único
método disponible que permite detectar infecciones causadas por
cualquiera de las especies y serogrupos de Legionella
(aproximadamente 15-20 % de las infecciones se deben a especies o
serogrupos diferentes de L. pneumophila serogrupo 1). Tiene
como inconveniente el tiempo que tarda en crecer el microorganismo, de
3 a 10-12 días.
- La sensibilidad del cultivo en muestras respiratorias oscila
entre un 20 y un 80% y varía en función del tipo de
muestra, siendo la especificidad del 100%. Esta baja sensibilidad se
debe, entre otros, a los siguientes factores: la naturaleza de la
bacteria que crece con dificultad aún en medios selectivos, la
limitada supervivencia de la bacteria en las muestras clínicas,
la aplicación de una terapia antibiótica previa a la
toma de muestra y la experiencia microbiológica requerida para
su aislamiento.
- Aunque se puede considerar un método tedioso e incluso de
difícil realización, es muy recomendable su utilización
de forma rutinaria, ya que permite realizar posteriores estudios que
ayudan a mejorar el conocimiento de la bacteria, como las
investigaciones epidemiológicas para detectar las posibles
fuentes de infección, o la realización de estudios de
sensibilidad frente a antimicrobianos.
- Las muestras recomendadas para realizar el cultivo de la
bacteria incluyen secreciones respiratorias, tejido pulmonar y sangre
y, en función del tipo y nivel de contaminación, pueden
ser agrupadas en:
- A) Secreciones respiratorias contaminadas: esputo expectorado y
muestras del tracto respiratorio inferior contaminadas con
microbiota del tracto respiratorio superior, como aspirados, lavados
o cepillados bronquiales.
- B) Secreciones respiratorias no contaminadas: muestras del tracto
respiratorio inferior no contaminadas, como las obtenidas con
cepillo telescopado y por aspiración pulmonar trasparietal.
C) Tejidos: tejido pulmonar obtenido por biopsia o necropsia, o
tejido de otros órganos. D) Otras muestras menos frecuentes,
como líquido pleural, líquido cefalorraquídeo
(LCR) o sangre.
- Para el cultivo de Legionella se utiliza un medio específico,
BCYEa (buffered charcoal yeast extract
suplementado con a -cetoglutarato), que
contiene los elementos requeridos por la bacteria, como hierro y cisteína,
y un medio selectivo suplementado con antibióticos, BMPA (BCYEa
suplementado con polimixina, cefamandol y anisomicina). Para el primer
aislamiento las placas deben incubarse a 35-37ºC, en condiciones
de aerobiosis y humedad, y aunque el crecimiento de la bacteria
generalmente empieza a ser visible a partir del 3er día
de incubación, los cultivos se deben mantener en estas
condiciones 10-12 días antes de considerarlos negativos. Pequeñas
cantidades de CO2 (2,5-5%) pueden favorecer el crecimiento
de algunas especies. Cuando se procesan muestras contaminadas (esputo)
se recomiendan tratamientos de descontaminación, ya que ayudan
a eliminar la microbiota acompañante y favorecen el
reconocimiento de las colonias de Legionella. Los tratamientos
utilizados son de 2 tipos, calor (50ºC 30 min) y tratamiento ácido
(pH de 2,2 durante 5 min).
- Como la mayoría de las cepas de Legionella
empleadas en el control de los medios de cultivo se adaptan rápidamente
a los medios tras sucesivos subcultivos, se recomienda la utilización
de un tejido infectado con la bacteria para comprobar el crecimiento.
- Aunque el género Legionella comprende 48 especies
y más de 70 serogrupos, la mayoría de los cultivos
recuperados de muestras de pacientes pertenecen a la especie L.
pneumophila, siendo L. pneumophila serogrupo 1 el que se
identifica con mayor frecuencia. Se debe tener en cuenta que mientras
L. pneumophila crece bien en los medios de cultivo utilizados,
no ocurre lo mismo con otras especies, que crecen con más
dificultad, requieren más tiempo y, en ocasiones pueden llegar
a perderse en subcultivos sucesivos.
- Las especies de Legionella pueden identificarse por una
variedad de métodos. Estos incluyen la inmunofluorescencia (IF)
con anticuerpos poli o monoclonales, aglutinación en porta o
con partículas de látex, ensayos con anticuerpos género-específicos
mediante dot-blot en colonias y amplificación específica
del ADN mediante técnicas de PCR. También se pueden
utilizar algunas pruebas bioquímicas, aunque no suelen ser muy útiles
debido a que aportan resultados variables.
- También recientemente se han desarrollado métodos
de secuenciación de fragmentos de genes, utilizando como dianas
el gen 16S ribosomal o el gen mip (macrophage infectivity
potentiator). La identificación se realiza por comparación
de la secuencia obtenida con las secuencias conocidas e incluidas en
las bases de datos de secuencias existentes. En el caso del fragmento
16S ribosomal se utiliza la base de datos "Gene Bank Database"
(www.ncbi.nlm.nih.gov
) y en el caso del gen mip la base de datos del EWGLI (www.ewgli.org).
- 5.3. DETECCIÓN DE Legionella
POR INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA
La microscopía directa con anticuerpos fluorescentes es un
método rápido y fue el primer método diagnóstico
usado para detectar Legionella en tejido pulmonar y
secreciones respiratorias. La inmunofluorescencia directa es un
procedimiento de tinción que permite detectar con rapidez la
presencia de cualquier serogrupo de L. pneumophila en
muestras clínicas. Se realiza con reactivos polivalentes,
algunos de los cuales están disponibles comercialmente. Estos
reactivos contienen un anticuerpo monoclonal capaz de reconocer todos
los serogrupos de L. pneumophila. Los anticuerpos, marcados
con fluoresceína, se unen a los antígenos de la pared de
L. pneumophila, un posterior lavado elimina los anticuerpos no
fijados y al examinar la extensión con un microscopio de
fluorescencia se puede observar la fluorescencia en la pared de estas
bacterias.
- Su realización está indicada cuando interese
alcanzar un diagnóstico etiológico rápido en una
neumonía o en otra infección sospechosa de estar causada
por Legionella. La sensibilidad del método oscila entre
el 25 y el 75% siendo la especificidad del 95%. Sin embargo, es un método
que tiene muchas limitaciones por lo que debe interpretarse con
cautela. Un resultado negativo no excluye la posibilidad de que el
paciente esté infectado por Legionella y un resultado
positivo debe interpretarse como un diagnóstico presuntivo. Por
ello, actualmente no se recomienda su utilización como único
método diagnóstico.
- 5.4. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO
Se han desarrollado una variedad de pruebas para detectar
anticuerpos específicos en muestras de suero, incluyendo
inmunofluorescencia indirecta (IFI), microaglutinación y métodos
de enzimo-inmunoensayo (ELISA), así como ensayos de
hemaglutinación indirecta y contrainmunoelectro-foresis. La IFI
ha sido el método diagnóstico más utilizado
durante años y por ello, el más evaluado, principalmente
para L. pneumophila serogrupo 1. Las pruebas de
microaglutinación presentan la ventaja de que por su facilidad
de realización permiten ensayar un gran número de
muestras a la vez, presentando una sensibilidad del 80% y una
especificidad que oscila entre el 97 y 99%. También existen
disponibles ensayos de ELISA para la detección de anticuerpos
frente a Legionella, aunque éstos no han sido
suficientemente evaluados.
- La IFI se realiza utilizando un sustrato antigénico de
L. pneumophila serogrupo 1 inactivado con calor, o un pool
conteniendo antígenos de varios serogrupos. Estos antígenos
están comercializados, estandarizados y prefijados en los
portaobjetos sobre los que se añaden diluciones seriadas del
suero del paciente. La detección de anticuerpos en el suero del
paciente se realiza mediante una reacción antígeno–anticuerpo
que se revela con una antiglobulina humana marcada con fluoresceína,
que permite la visualización de los microorganismos con un
microscopio de fluorescencia. La sensibilidad de la IFI oscila entre
78-91%, siendo la especificidad del 99%.
- Para la determinación del título de anticuerpos en
el suero de un paciente es preferible realizar un ensayo de IFI en una
pareja de sueros, tomados en la fase aguda y convaleciente de la
enfermedad, para demostrar una seroconversión (aumento del título
al menos al cuádruple). Se considera positiva una seroconversión
en la que el segundo suero presente un título >
1/128. La seroconversión se produce en alrededor del 70-80% de
los casos confirmados con cultivo, se puede producir en la primera
semana tras el inicio de los síntomas, aunque también
puede requerir de 6 semanas a 2 meses en aparecer, e incluso no
producirse.
- Cuando se cuenta con un suero único la interpretación
de los resultados en más compleja, ya que el nivel de
anticuerpos de la población general puede variar de unos
lugares a otros, y en general este nivel no se conoce. Por ello, títulos
superiores a 1/256 son sugerentes de enfermedad reciente o pasada,
pero títulos inferiores a este valor deben considerarse
negativos. Por otro lado, un resultado negativo no descarta la
enfermedad, ya que en ocasiones se han detectado fallos en la producción
de anticuerpos.
- Para aumentar la sensibilidad es importante utilizar reactivos
que detecten inmunoglobulinas totales (IgG, IgM e IgA).
- Aunque la IFI ha sido una herramienta diagnóstica de gran
utilidad, las limitaciones que presenta y el tiempo requerido en tener
un resultado hacen que en los últimos años haya
disminuido su uso, sin embargo es de gran utilidad para realizar diagnósticos
retrospectivos y en investigaciones epidemiológicas.
- 5.5. DETECCIÓN DE ANTÍGENO DE
L. pneumophila EN MUESTRAS DE ORINA
En el transcurso de un episodio neumónico por L.
pneumophila se libera antígeno específico que puede
detectarse en la orina. La detección de este antígeno
ofrece un diagnóstico rápido de confirmación de
neumonía por L. pneumophila reciente o pasada, por lo
que estos ensayos se deberán realizar únicamente en
presencia de un cuadro clínico compatible, o con menor sospecha
clínica en el caso de brotes hospitalarios. Estas técnicas
han revolucionado el diagnóstico de esta enfermedad y han
mostrado ser extraordinariamente útiles, ya que permiten la
detección de un mayor número de casos y la aplicación
de un tratamiento antibiótico específico en las fases
iniciales de la enfermedad. También permiten el reconocimiento
temprano de brotes epidémicos, favoreciendo una rápida
respuesta en la aplicación de medidas preventivas.
- El antígeno detectado es un componente soluble del
lipopolisacárido (LPS) de la pared celular de Legionella,
es termoestable, y es detectable desde el inicio de la sintomatología,
y en algunos casos hasta muchos meses después (en algún
caso hasta más de 1 año), no viéndose los
resultados claramente influenciados por la administración
previa de antibióticos.
- Estos antígenos se han detectado por varias técnicas,
como aglutinación con partículas de látex,
hemaglutinación pasiva y radioinmunoensayo (RIA). La primera técnica
disponible comercialmente que demostró ser una técnica útil,
sensible y específica, fue el RIA, que presentaba una
sensibilidad del 60% en orina directa y del 80% en orina concentrada,
siendo la especificidad en ambos casos del 100%. La utilización
de la técnica del RIA exigía disponer de instalaciones
adecuadas para trabajar con isótopos radioactivos, por lo que
ha sido sustituida por técnicas de enzimoinmunoensayo (EIA) de
similares características, que se han incorporado a muchos
laboratorios.
- En la actualidad existen varias técnicas de EIA
comercializadas, siendo las de Binax, Biotest y Bartels las más
utilizadas. La sensibilidad empleando orina concentrada es similar en
los tres EIA (80-90%), con una especificidad del 98-100%, destacando
la elevada sensiblidad del EIA de Bartels empleando orina directa
(60-75%), que casi permite obviar la necesidad de concentrar la orina.
El diseño propio de estas técnicas y la baja incidencia
de infecciones por Legionella en algunas áreas provoca
que se tenga tendencia a acumular muestras hasta tener un número
suficiente para optimizar los pocillos, con el consecuente retraso en
la obtención de los resultados, lo cual atenta directamente
contra la principal ventaja de estas técnicas.
- Hoy día, se dispone también de una técnica
de inmunocromatografía (ICT) más rápida, que
ofrece resultados en 15 minutos o menos dependiendo de la concentración
de antígeno en la orina. Es técnicamente menos compleja
que las técnicas de EIA, no requiere equipamiento específico
y se realiza de forma individualizada. Los resultados obtenidos son
absolutamente equiparables con los de las técnicas de EIA en
sensibilidad y especificidad, exhibiendo específicamente una
concordancia global con el EIA de Binax del 98%.
- Todas las técnicas descritas detectan con una gran
sensibilidad el antígeno de L. pneumophila serogrupo 1,
siendo además capaces de detectar "in vitro" antígeno
soluble de todos los serogrupos de L. pneumophila. El EIA
de Biotest es el único que según el fabricante tiene
capacidad para detectar todos los serogrupos de L. pneumophila,
así como otras especies de Legionella, aunque no
garantiza la misma sensibilidad para todos los serogrupos y especies.
- La capacidad de detectar antígeno de otros serogrupos está
en función de las características propias de cada antígeno,
como la capacidad de pasar a la orina, la cantidad excretada y su
inmunogenicidad. Los antígenos de otros serogrupos de L.
pneumophila podrían no excretarse por la orina, ya que
pueden pasar a través de las paredes de los capilares
glomerulares o no hacerlo, en función de su tamaño y de
su carga.
- Es interesante destacar que el tratamiento térmico de la
orina no supone la desaparición de la positividad y sí
la eliminación de falsos positivos en muestras negativas. También
es importante conocer que la concentración del antígeno
presente en la orina por ultrafiltración selectiva incrementa
significativamente la sensibilidad sin que se vea afectada la
especificidad.
- 5.6. DETECCIÓN DE Legionella EN
MUESTRAS CLÍNICAS POR TÉCNICAS DE PCR
La gran ventaja que presenta el aislamiento en cultivo como método
de referencia es la disponibilidad del microorganismo, lo cual permite
la realización de posteriores estudios de caracterización
con fines taxonómicos y epidemiológicos. Sin embargo, el
aislamiento en cultivo de este microorganismo presenta una serie de
dificultades como son: 1) La pérdida progresiva de viabilidad
de la bacteria tras la toma de muestra. 2) El enmascaramiento de las
colonias cuando se procesan muestras contaminadas (esputo), donde el éxito
en el aislamiento de la bacteria está correlacionado con el número
de estos microorganismos presentes en la muestra. 3) El tiempo
requerido para la obtención de los resultados, que en ocasiones
es alto.
- Para solventar estos inconvenientes, en los últimos
tiempos, se han desarrollado métodos diagnósticos
basados en la detección de ADN de Legionella en
muestras humanas, utilizando métodos de hibridación con
sondas génicas específicas o basados en la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR). La reacción de PCR consiste
en la amplificación "in vitro" de ADN o ARN mediante
la acción de una ADN polimerasa termorresistente (Taq
polimerasa), a partir de una secuencia definida de una cadena de ADN
utilizada como punto de inicio. Aunque estas técnicas han
revolucionado en los últimos años el campo diagnóstico
de las enfermedades infecciosas debido a su gran rapidez,
sensibilidad, especificidad y versatilidad, sin embargo, en el caso deLegionella,
los primeros ensayos no cumplieron las expectativas y en alguna ocasión
una vez comercializados fueron retirados del mercado. A pesar de estos
inicios poco prometedores, se han desarrollado métodos
dirigidos principalmente a tres dianas del cromosoma bacteriano: el
gen mip (macrophage infectivity potentiator) y los
genes 5S rRNA y 16S rRNA del ribosoma. Los productos de amplificación
se detectan mediante la visualización de los amplicones con
bromuro de etidio tras su separación en geles de agarosa,
mediante hibridación con sondas específicas o mediante
secuenciación.
- Sin embargo, uno de los principales inconvenientes de la PCR
convencional es que se trata de un método cualitativo, por lo
que el empleo de diferentes sondas marcadas fluorogénicamente
en un sistema de PCR a "tiempo real" está desplazando
el uso de la PCR convencional. Este método permite la
cuantificación del número de células presentes en
la muestra, y además reduce el riesgo de contaminaciones y el
tiempo requerido en el procesamiento de las muestras, eliminando la
necesidad de un análisis posterior de los amplicones obtenidos.
Si a esto se añade la posible utilización de una PCR múltiple
que además de detectar L. pneumophila permita la
detección simultánea de otros microorganismos causantes
de neumonía, como Chlamydophila pneumoniae y Mycoplasma
pneumoniae, el valor de esta metodología se podría
ver muy incrementado en el diagnóstico etiológico de las
neumonías atípicas adquiridas en la comunidad.
- Sin embargo, estos ensayos basados en la PCR son escasos y aún
se encuentran en fase experimental, por lo que ninguno de ellos se
utiliza en la actualidad de forma rutinaria en el diagnóstico
de infecciones causadas por Legionella. A esto hay que añadir
la presencia de inhibidores en las muestras clínicas, como
hemoglobina, urea o heparina, que pueden dar lugar a la aparición
de falsos negativos debidos a inhibición de la amplificación,
por lo que es fundamental la preparación de la muestra de modo
que se eliminen eficazmente estos inhibidores.
- 6. PREVENCIÓN
Y CONTROL DE LA LEGIONELOSIS
6.1. MEDIDAS GENERALES DE PREVENCIÓN Y
CONTROL
Conocer los factores que favorecen la transmisión de Legionella
y su nicho ecológico (detallados anteriormente) proporciona una
información de gran utilidad a la hora de abordar la prevención
de la enfermedad. El desarrollo de la enfermedad depende
principalmente de la intensidad de la exposición a aerosoles,
medida por el tiempo de exposición y por la concentración
de la bacteria en el aerosol y, de la susceptibilidad de las personas
expuestas. Por ello, las medidas de prevención y control de la
enfermedad que se proponen van en dos direcciones, de un lado evitar
las condiciones que favorecen la supervivencia y multiplicación
de la bacteria, mediante la limpieza de las instalaciones y el control
de la temperatura del agua, y de otro lado, controlar la eliminación
de los aerosoles, evitando que su eliminación se realice en
zonas muy transitadas, en lugares cercanos a ventanas o tomas de aire
de otros sistemas, o en lugares donde las personas expuestas sean
especialmente susceptibles.
- En general, en instalaciones que acumulan agua y pueden generar
aerosoles los aspectos técnicos que ayudan a minimizar la
multiplicación de la bacteria se pueden resumir en, al menos, 5
puntos:
- 1) Evitar temperaturas de almacenamiento o distribución de
agua comprendidas entre 25ºC y 45ºC.
- 2) Evitar la presencia de suciedad, la acumulación de
sustratos y la formación de biocapas.
- 3) Evitar el estancamiento del agua, especialmente importante en
lugares donde hay escasez de agua, en instalaciones con
funcionamiento intermitente (por temporada baja, períodos
vacacionales, reparaciones, etc.), así como en sistemas de
agua complejos, como por ejemplo los sometidos a modificaciones.
- 4) Evitar la utilización de materiales que favorecen el
crecimiento de microorganismos, o que se degraden por efecto del
cloro o la temperatura, o que sean de difícil limpieza.
- 5) Poner todos los medios disponibles para que el sistema opere
correctamente y en buenas condiciones de mantenimiento. Es
importante introducir programas de revisión, limpieza y
desinfección periódicas, así como realizar
muestreos y análisis periódicos.
- Para aplicar estas medidas debe organizarse un plan de
mantenimiento de las instalaciones en el que es importante contemplar,
al menos, los siguientes aspectos:
- 1) Cada instalación debe conocerse en su totalidad,
mediante la elaboración de planos, que deben ser completos y
actualizados. También se deben identificar los puntos de la
instalación que presenten un riesgo de exposición a
aerosoles (puntos de riesgo), teniendo en cuenta a las personas (número
y estado de salud) expuestas. Todo ello para adoptar un plan de
medidas encaminadas a disminuir este riesgo.
- 2) El plan de mantenimiento debe incluir una clara distribución
de tareas entre personal suficientemente entrenado, y se debe
establecer un sistema ágil de comunicación entre todos
los responsables.
- 3) Existencia de un libro de mantenimiento actualizado en el que
se registren todas las incidencias y actividades realizadas y se
reflejen los resultados obtenidos.
Estos aspectos se encuentran recogidos en el Real
Decreto 865/2003, en Órdenes o Decretos de prevención de
legionelosis de algunas Comunidades Autónomas (Madrid,
Valencia, Cataluña, Galicia, Extremadura, Navarra, Andalucía,
Cantabria, detalladas en orden cronológico de su publicación),
y en la norma UNE 100030 IN 2001.
- 6.2. PREVENCIÓN Y CONTROL DE
LEGIONELOSIS EN HOSPITALES
Se ha revisado detalladamente la prevención de
legionelosis en hospitales, según la legislación vigente
en nuestro país, las recomendaciones de diferentes organismos
internacionales y las experiencias profesionales de Sabrià y
cols.
6.2.1. Circunstancias favorecedoras de la
legionelosis hospitalaria
En los centros sanitarios coinciden una constelación de
factores que favorecen la incidencia y gravedad de las legionelosis.
Se han documentado muchos brotes prolongados en hospitales, que se han
atribuido a la contaminación de los sistemas de abastecimiento
de agua. Muchos hospitales describen experiencias de casos o brotes
sucesivos en el tiempo, que en la mayor parte de las ocasiones suelen
corresponder a legionelosis nosocomial endémica, situación
frecuente en la actualidad.
- Actualmente se consideran muy poco probables los brotes
nosocomiales asociados a torres de refrigeración, sin embargo,
estas instalaciones han estado implicadas en brotes de legionelosis
comunitaria, produciendo en ocasiones un elevado número de
casos, por lo que también deben ser consideradas.
- Concentración de enfermos de riesgo. En los
hospitales hay enfermos con diferentes tipos de inmunodepresión
y, por tanto, con un riesgo elevado de desarrollar formas graves de
legionelosis. Los casos de legionelosis de adquisición
nosocomial tienen unos costes asociados y una mortalidad más
alta que los comunitarios.
- Los factores que más predisponen para la adquisición
de la enfermedad se concentran en el ámbito hospitalario:
tratamiento inmunodepresor (terapia antirrechazo en los enfermos con
transplante de médula ósea u órgano sólido),
y una serie de procesos de base, como neoplasias, quimioterapia citotóxica,
diabetes, insuficiencia renal terminal y diferentes procesos que
exigen el uso de glucocorticoides. Existe también un moderado
incremento del riesgo en personas de más de 65 años,
fumadores, pacientes con enfermedad respiratoria crónica o
insuficiencia cardiaca y en los alcoholicos. En los enfermos con SIDA,
aunque la incidencia de legionelosis es similar a la de la población
no infectada por el VIH, la enfermedad suele ser más grave.
- Algunos autores han señalado también la fuerte
asociación existente entre Legionella y cirugía,
debido a que cerca del 90% de los casos nosocomiales publicados se han
producido en pacientes operados. Estos autores han indicado que las
infecciones por Legionella aumentan con el uso de anestesia
general y la intubación endotraqueal; han insistido también
en el hecho de que los factores de riesgo para la legionelosis
nosocomial son los mismos que los de las neumonías por aspiración.
- Estructuras de soporte hidromecánico que favorecen la
contaminación de las aguas. El reservorio clínico de
Legionella en los hospitales es, con gran frecuencia, el
sistema de distribución de agua sanitaria caliente, aunque
también puede verse implicado el circuito de agua sanitaria fría.
En los últimos años las torres de refrigeración
han perdido protagonismo como origen de los casos de legionelosis
nosocomial.
- Los hospitales suelen ser edificios grandes, que disponen de
redes de agua sanitaria caliente complejas y, a menudo, de torres de
refrigeración. Si bien ambos sistemas son reservorios conocidos
de infección por Legionella, en los últimos años
la mayoría de casos esporádicos y brotes de legionelosis
en hospitales se han relacionado con la exposición al agua de
las redes de agua sanitaria que con frecuencia están
colonizadas por Legionella.
- Diferentes estudios han demostrado que la colonización de
los sistemas de agua sanitaria de los hospitales por Legionella
oscila entre el 12 y el 80%. Entre los factores que condicionan la
contaminación de las aguas de los centros sanitarios destacan
el diseño del sistema de distribución de agua sanitaria,
la antigüedad del mismo, la temperatura, el pH, la composición
iónica y la conductividad del agua, así como los
materiales empleados para la fabricación de cañerías
y válvulas. Además, el volumen, la disposición y
la antigüedad de los acumuladores influyen en la concentración
de Legionella.
- Las siguientes variables han sido relacionadas con la colonización
de los hospitales por Legionella: tamaño del hospital,
presencia de acumuladores de gran tamaño, baja temperatura en
los puntos periféricos del sistema de agua caliente e
intercambiadores de calor antiguos.
- Es también un hecho probado que uno de los factores clave
de la legionelosis nosocomial es el de la amplificación del inóculo.
La reapertura de tramos del circuito de agua sanitaria reparados, en
los que ha hiperproliferado Legionella, justifican muchos de
los brotes hospitalarios.
- La despresurización y el consiguiente estancamiento del
agua en las plantas más elevadas del hospital durante las horas
de máximo consumo, o la reparación y puesta en marcha de
una bomba de recirculación, son circunstancias que amplifican
enormemente el inóculo bacteriano y ponen en peligro a la
población hospitalaria.
- Otro aspecto determinante de la colonización por Legionella
es la temperatura de las aguas, ya que Legionella es
termotolerante. Desde el año 1.998, el Reglamento de
Instalaciones Térmicas de Edificios (RITE) (Real Decreto
1751/1998), a diferencia de otras reglamentaciones previas más
tolerantes, obliga a que las temperaturas de acumulación sean
como mínimo de 55ºC (siendo recomendables los 60ºC),
de forma que en el punto más distal de la red la temperatura mínima
sea de 50ºC. De todos modos, las altas temperaturas influyen
negativamente en la vida de las cañerías, pueden
incrementar los depósitos calcáreos que facilitan la
colonización por Legionella y disminuyen la capacidad
desinfectante del cloro al facilitar su evaporación.
- Otro aspecto importante a tener en cuenta es la formación
de biocapas en el interior de cañerías, acumuladores e
interiores de las torres de refrigeración, donde Legionella
utiliza la presencia de otros microorganismos (bacterias, amebas,
protozoos ciliados y algas) para su supervivencia y multiplicación.
Por ejemplo, los sistemas de distribución de agua sanitaria se
hallan frecuentemente colonizadas por Hartmannella vermiformis.
La formación de estas biocapas se ve favorecida por el
estancamiento del agua, existencia de ramales o tramos ciegos de uso
infrecuente, la disminución del flujo de agua, los materiales
usados en la construcción de las cañerías o de
las bombas, y la temperatura del agua. Las biocapas facilitan el
crecimiento de Legionella y la protegen frente a la acción
de los biocidas y las técnicas de prevención aplicadas
contra ella, como son el hipercalentamiento o la hipercloración.
- 6.2.2. Fuentes de exposición
hospitalarias
El hospital ofrece múltiples fuentes potenciales de
exposición. Los aerosoles más habitualmente implicados
en la aparición de legionelosis nosocomial son los generados
por las duchas y grifos de agua caliente de los lavabos.
- La colonización orofaríngea y la aspiración
de agua sanitaria podrían explicar algunos casos. Se han
descrito casos asociados con el uso de nebulizadores y equipos de
terapia respiratoria, material de irrigación, piscinas de
hidroterapia, equipos de extinción de incendios utilizados
recientemente y cubitos de hielo producidos por máquinas
situadas en plantas de hospitalización, entre otras fuentes.
- Aunque las torres de refrigeración son una causa poco
probable de brotes nosocomiales, éstas también deben ser
consideradas.
- 6.3. DETECCIÓN DE LEGIONELLA EN
MUESTRAS DE AGUA
Legionella es una bacteria ampliamente distribuida en ambientes
acuáticos, sin embargo, su presencia en un sistema de agua no
es suficiente para que se produzca enfermedad.
La búsqueda de Legionella en una muestra de agua
puede tener diferentes finalidades: 1) Detectar las fuentes de infección
implicadas en brotes/casos de legionelosis. 2) Determinar la eficacia
de tratamientos aplicados en instalaciones asociadas a casos, o
incluidas en los planes de mantenimiento, en cumplimiento de la
legislación de prevención de legionelosis vigente. 3)
Conocer la situación de las instalaciones de riesgo en los
hospitales en relación a Legionella, en cumplimiento de
los programas de prevención de legionelosis, con independencia
de su relación con casos.
- La finalidad de estos análisis es la detección de
la bacteria en la instalación a estudiar, por lo que deben
optimizarse todos los pasos del procedimiento, incluyendo la toma de
muestra, que será diseñada en función de la
finalidad del análisis.
- Un resultado negativo no excluye la presencia de la bacteria en
la instalación analizada, por lo que no debe trasmitir una
sensación (falsa) de seguridad. Un resultado positivo debe
acompañarse de una medida correctora que disminuya o elimine la
bacteria.
- Los métodos disponibles de detección de Legionella
en aguas incluyen el cultivo e identificación de la bacteria,
el enzimoinmunoensayo (EIA) de similares características al
utilizado en la detección de antígeno en muestras de
orina, y la amplificación de un fragmento específico del
genoma de la bacteria mediante técnicas de PCR.
- 6.3.1. Cultivo e identificación de
Legionella en muestras de agua
El aislamiento de la bacteria en cultivo es el método de
referencia y se basa en la norma ISO 11731/98. Es el único método
disponible que permite detectar cualquier especie y serogrupo de Legionella.
Se ha demostrado que L. pneumophila es la especie más
frecuentemente recuperada de muestras ambientales, siendo la
prevalencia del serogrupo 1 similar a la de la suma de otros
serogrupos de L. pneumophila, a diferencia de lo que ocurre en
humanos, donde L. pneumophila serogrupo 1 es el predominante.
- El cultivo permite la realización de estudios posteriores,
como las investigaciones epidemiológicas dirigidas a detectar
las fuentes de infección causantes de los casos, ensayos de
sensibilidad frente a productos biocidas y análisis
moleculares. Tiene como inconveniente el tiempo que tarda en crecer el
microorganismo, de 3 a 12-15 días.
- Antes de realizar el cultivo de Legionella a partir de
muestras de agua, es necesario realizar una adecuada toma de muestra.
Para su aislamiento en cultivo, al igual que ocurre en el
procesamiento de muestras clínicas, estos microorganismos
requieren medios específicos, como BCYEa
que contiene los elementos requeridos por la bacteria (hierro y cisteína)
y medio selectivo suplementado con antibióticos, como GVPC
(BCYEa suplementado con glicina,
vancomicina, polimixina y cicloheximida). Se obtienen colonias
visibles a partir del 3º-7º día de incubación
a 35-37ºC y en condiciones de aerobiosis y humedad, aunque en
ocasiones pueden requerir hasta 12-15 días de incubación.
Pequeñas cantidades de CO2 (2,5-5%) pueden
favorecer el crecimiento de algunas especies. Como en las muestras de
agua la concentración de Legionella puede ser baja, y
además puede ir acompañada de otro tipo de microbiota,
es necesario concentrar y reducir la microbiota acompañante
presente en las muestras antes de inocular los medios de cultivo.
- Los métodos de identificación de los cultivos son
los mismos que los utilizados en la identificación de cultivos
de origen humano.
- 6.3.2. Detección de antígeno
de L. pneumophila serogrupo 1 en muestras de agua
Se ha desarrollado un método capaz de detectar antígeno
de L. pneumophila serogrupo 1 en muestras de agua mediante un
ensayo de EIA, que está disponible comercialmente (Binax,
Portland, USA). Aunque el mismo fabricante tiene comercializados
ensayos parecidos para la determinación de antígeno en
muestras de orina y muestras de agua, los ensayos no son
intercambiables y cada uno de ellos debe usarse únicamente con
el tipo de muestra para la que fué diseñado. Este un
ensayo de EIA ofrece una alternativa rápida para la detección
de antígeno de L. pneumophila serogrupo 1 en muestras
de agua, tanto potable como de torres de refigeración.
- El ensayo puede realizarse en menos de 1 hora y en el mismo lugar
de la toma de muestra, y se se realiza en unos tubos de reacción
que contienen el anticuerpo al que se añade la muestra de agua
y el anticuerpo conjugado con peroxidasa. Los antígenos de L.
pneumophila serogrupo 1 quedarán unidos por un lado a los
anticuerpos de las paredes del tubo y por otro a los anticuerpos con
la peroxidasa. Tras varios lavados se eliminan los antígenos no
unidos, y la presencia de peroxidasa se revela añadiendo un
colorante combinado con peróxido de hidrógeno. Se
produce un color azul que se tornará amarillo tras la adición
de la solución de parada. Finalmente se mide la intensidad del
color amarillo con un espectrofotómetro, y la absorbancia leída
será proporcional a la cantidad de antígeno de L.
pneumophila serogrupo 1 existente.
- La sensibilidad de este ensayo se ha determinado estudiando aguas
en las que se inocularon previamente concentraciones conocidas de L.
pneumophila serogrupo 1. Así, para agua potable el límite
de detección es 70 ufc/ml y el volumen de muestra recogida no
debe ser inferior a 1 L. Para aguas procedentes de torres de
refrigeración el límite de detección es de 800
ufc/ml con un volumen de muestra de al menos 100 ml, y de 200 ufc/ml
para volúmenes no inferiores a 500 ml. No se deben recoger
sedimentos ni restos de las paredes de los depósitos.
- En cuanto a la especificidad del test, no se han observado
reacciones cruzadas con bacterias como Staphylococcus aureus,
Acinetobacter spp., Aeromonas hydrophila, Citrobacter
freundii, Citrobacter koseri, Enterobacter cloacae, Escherichia coli,
Klebsiella oxytoca, Klebsiella terrigena, Yersinia ruckeri,
Pseudomonas aeruginosa y diferentes especies de otros bacilos
gramnegativos no fermentadores, a concentraciones superiores a 108
ufc/ensayo. La única excepción con la que se puede
producir una reacción cruzada es Pseudomonas fluorescens.
- Un resultado negativo no descarta la presencia de la bacteria en
la muestra de agua analizada, ya que L. pneumophila serogrupo
1 podría encontrarse en concentraciones inferiores al límite
de detección del método. También se produce un
resultado negativo si la muestra de agua contiene una Legionella
distinta de L. pneumophila serogrupo 1. Además, el método
no diferencia entre bacterias vivas o muertas, por lo que no está
recomendada su utilización después de la aplicación
de tratamientos con biocidas, ya que se podrían obtener falsos
positivos debido a la presencia de bacterias muertas.
- 6.3.3. Detección de Legionella
en muestras de agua con técnicas de PCR
Al igual que con las muestras clínicas, la gran ventaja
que presenta el aislamiento en cultivo como método de
referencia es la disponibilidad de la bacteria, para la realización
de estudios posteriores. Sin embargo, también presenta una
serie de inconvenientes, como son la imposibilidad de detectar
bacterias viables no cultivables y el enmascaramiento de los cultivos
cuando las muestras proceden de sistemas biocontaminados. Además,
el tiempo requerido para la obtención de un resultado es
generalmente largo de cara a la necesidad de establecer una actuación
rápida ante la presencia de la bacteria.
- Para salvar estas dificultades, en los últimos años
también se han desarrollado métodos de detección
de Legionella basados en la amplificación del ADN
cromosómico en muestras de agua mediante PCR. Los ensayos se
han dirigido fundamentalmente a las mismas dianas utilizadas con
muestras respiratorias, el gen mip y los genes ribosómicos
5S ARNr y 16S ARNr. Básicamente, la investigación de
Legionella por PCR se efectúa en 3 fases: 1)
Concentración por filtración o centrifugación. 2)
Lisis bacteriana, extracción y purificación de los ácido
nucleicos. 3) Amplificación de una o varias secuencias específicas
mediante PCR. La visualización de los productos amplificados se
ha realizado en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio
o mediante hibridación o secuenciación.
- Al igual que en las muestras clínicas, uno de los
principales inconvenientes de la PCR convencional es que se trata de
un método cualitativo. El empleo de un sistema de PCR a "tiempo
real" permite la cuantificación del número de células
presentes en la muestra, reduce el riesgo de contaminaciones, así
como el tiempo requerido en el procesamiento de las muestras,
eliminando la necesidad de un análisis posterior de los
amplicones obtenidos. Recientemente se ha publicado la detección
y cuantificación de L. pneumophila basada en la
amplificación del gen dotA (defective organelle
trafficking), un gen implicado en la infectividad del
microorganismo.
- Otro de los inconvenientes de la PCR es la imposibilidad de
diferenciar entre células vivas y muertas, debido
fundamentalmente a la persistencia del ADN una vez que la bacteria ha
muerto. Para solventar este problema se han comenzado a emplear moléculas
diana diferentes, que se emplean como marcadores de viabilidad, y uno
de los mejores candidatos propuestos es el ARNm, debido principalmente
a su corto tiempo de vida medio. De esta manera, mediante una reacción
de PCR a tiempo real previa se puede obtener un ADNc específico,
que se puede amplificar por PCR como cualquier muestra de ADN,
permitiendo la detección de células con actividad metabólica,
y en consecuencia, células vivas.
- También la gran variedad de inhibidores de la PCR que
pueden encontrarse presentes en muestras medioambientales puede
dificultar su desarrollo. Se han descrito varios métodos para
su eliminación como: 1) La filtración a través de
resinas de exclusión molecular o de intercambio iónico
como el Chelex-100® (Bio Rad), para evitar la materia orgánica
y metales pesados. 2) La adición de polivinilpirrolidona para
la eliminación de fenoles. 3) La separación de las células
mediante partículas inmunomagnéticas. Sin embargo,
actualmente no existe un método universalmente aceptado que
permita obtener resultados reproducibles en todo tipo de muestras, por
lo que resulta necesario seguir desarrollando nuevos métodos de
eliminación de inhibidores de la reacción.
- Un resultado obtenido mediante PCR convencional se debe expresar
como presencia o ausencia de Legionella (o L. pneumophila
en el caso de investigar la especie en lugar del género) en el
volumen de agua analizado, o como el número de células
de Legionella en el volumen de agua analizado, en el caso de
una PCR cuantitativa o a "tiempo real". Además, se
deberá incluir en los ensayos una serie de controles necesarios
para su validación, como los que se indican a continuación:
- -Control proceso positivo: consiste en una muestra de agua estéril
conteniendo una número conocido de células de L.
pneumophila que se procesa de igual modo que las muestras a
analizar y que permite comprobar la eficacia de los procesos que se
efectúan.
- -Control de proceso negativo: consiste en una muestra de agua estéril,
que se procesa de igual modo que las muestras a analizar y que
permite controlar la contaminación en todos los procesos que
se efectúan.
- -Recta de calibrado: en el caso de la PCR a "tiempo-real",
paralelamente a las muestras ensayadas se preparará una recta
de calibrado, como mínimo de cinco puntos de concentración
diferentes y que se analizarán por triplicado cada uno de
ellos.
- -Control negativo de PCR: consiste en una muestra de agua estéril
que se amplifica paralelamente a las muestras y que permite
garantizar la ausencia de contaminación por ADN.
- -Control positivo de PCR: consiste en una muestra conteniendo un
número de copias conocido del fragmento diana de Legionella.
En el caso de PCR cuantitativa, se emplearán dos muestras con
número de copias diferentes que se interpolarán en la
recta de calibrado preparada.
- -Control interno de inhibición (CIP): debe ser un
fragmento de ADN que se amplifica con el mismo juego de cebadores
que el fragmento diana, pero que tiene un tamaño diferente en
el caso de la PCR convencional, o bien que hibrida con una sonda de
secuencia diferente en el caso de la PCR cuantitativa o a "tiempo-real".
De este modo se puede evaluar en cada muestra la presencia de
inhibidores de la reacción.
- La automatización del proceso de preparación de
muestras, y el desarrollo de un método que permita la detección
y tipificación de L. pneumophila serogrupo 1 en el
mismo ensayo, incrementarán el valor de esta metodología.
- 6.4. INVESTIGACIÓN DE BROTES DE
LEGIONELOSIS
La aparición de varios casos de legionelosis debe hacer
sospechar un origen ambiental común, debido a la proliferación
y emisión de Legionella a partir de algún
sistema contaminado. Ello debe desencadenar una rápida
investigación multidisciplinar que incluya aspectos epidemiológicos,
microbiológicos y ambientales, con el objetivo de identificar,
en el menor tiempo posible, el foco productor de los aerosoles
contaminados origen de la infección. Los resultados obtenidos
en la investigación deben ser concordantes y, en cualquier
caso, su valoración debe ser conjunta para orientar y
garantizar una correcta interpretación de los mismos.
La aparición de un brote debe hacer reforzar las medidas
de vigilancia clínica y epidemiológica de la neumonía,
la disponibilidad de métodos para su diagnóstico, así
como reforzar las medidas de vigilancia ambiental y la capacidad de
intervención.
El estudio de un brote de legionelosis debe incluir, al menos los
aspectos que se detallan a continuación.
6.4.1. Definición de brote
Un brote de legionelosis se define como la aparición de 2
o más casos relacionados epidemiológicamente.
6.4.2. Creación de un grupo de
trabajo
En este grupo deben participar técnicos de todos los
servicios relacionados con la investigación, servicios de
neumología (incluso servicios de urgencias), microbiología
clínica, vigilancia epidemiológica, sanidad ambiental, y
microbiología ambiental. Es importante mantener una estrecha
colaboración entre todos los especialistas que intervienen y
realizar reuniones periódicas para consensuar los pasos a
seguir y cómo se han de realizar. En caso de que se considere
necesario informar a la opinión pública, se definirá
con claridad quién y cómo se informará.
6.4.3. Estudio epidemiológico
Para la definición de caso se utilizarán los
criterios epidemiológicos (acotando el período de tiempo
y el área geográfica implicada) y los de diagnóstico
clínico y microbiológico recogidos en los protocolos de
las enfermedades de declaración obligatoria de la Red Nacional
de Vigilancia Epidemiológica (Centro Nacional de Epidemiología).
Después de aceptar la definición de caso se
procederá a realizar una encuesta epidemiológica que
incluya las variables de persona, lugar y tiempo, y las variables de
exposición de los pacientes a las posibles fuentes de infección.
El estudio de la aparición de casos en el tiempo ayuda a
determinar el período posible de exposición. La
localización geográfica de los casos puede ayudar a
filiar el origen del brote y a delimitar el área en el que se
realizarán los estudios ambientales. Los casos pueden agruparse
en función del lugar de residencia, lugar de trabajo, visitas
frecuentes a lugares comunes, estancia en algún complejo
concreto, como hospital, hotel, balneario, centro de ocio, o bien
distribuirse heterogéneamente por todo un área geográfica.
6.4.4. Estudio ambiental
Es fundamental que los expertos comunitarios de sanidad ambiental
investiguen las posibles fuentes de infección en el área
geográfica relacionada con los casos, siguiendo la normativa
indicada en el Real Decreto 865/2003 y en los Decretos u Órdenes
publicados en la Comunidad Autónoma implicada.
La encuesta ambiental debe recoger información sobre cada
instalación, sus condiciones higiénico-sanitarias y régimen
de funcionamiento. Además debe recoger cualquier incidencia
ocurrida en el período anterior (al menos un mes) a la aparición
de los primeros casos, sobre todo las incidencias que implicaron la
parada y nueva puesta en funcionamiento de la instalación.
El estudio ambiental debe incluir la toma de muestras de agua de
las instalaciones revisadas, que tiene por objeto detectar la
presencia de la bacteria mediante su aislamiento en cultivo y su
posterior identificación.
Es importante que la toma de muestras de agua se realice lo antes
posible, y siempre, antes de proceder a la aplicación de
cualquier tratamiento de desinfección. Si las muestras de agua
se toman pasadas 48-72 horas desde la aparición de los primeros
casos, no se tiene la seguridad de que la toma se realiza en ausencia
de desinfectantes. En edificios/instalaciones que hayan sido sometidos
a tratamiento de desinfección, se deben dejar pasar al menos 15
días desde el tratamiento para realizar la toma de muestras.
6.4.5. Formulación de hipótesis
Con los datos del estudio epidemiológico y los derivados
de la investigación ambiental se establecerá la hipótesis
más plausible sobre la/s posible fuente/s de infección
causante de los casos. La hipótesis será comprobada
posteriormente mediante los estudios epidemiológicos analíticos,
como los de cohorte y de casos y controles, y los de epidemiología
molecular. Los estudios epidemiológicos serán
especialmente útiles cuando no se resuelva el brote con las
medidas adoptadas.
6.4.6. Medidas a tomar
En función del tipo de infección y de los
resultados de la investigación ambiental, y pendientes de
comprobar la hipótesis establecida, se deben tomar las primeras
medidas de prevención que se consideren más oportunas
para controlar el brote. Algunas de estas medidas se encuentran
recogidas en el Real Decreto 865/2003 y en Decretos de algunas
Comunidades Autónomas, y básicamente son de 3 tipos:
limpieza y desinfección, reparación de defectos
estructurales o de funcionamiento y paralización parcial o
total de la instalación.
Una vez terminada la investigación del brote y
establecidas las conclusiones que de ella deriven se adoptarán
las medidas de prevención a largo plazo que se consideren más
eficaces.
6.4.7. Estudios de epidemiología
molecular
L. pneumophila serogrupo 1 es la más implicada en
infección humana y también es la más distribuida
en el ambiente, por lo que la identidad de especie y serogrupo no será
suficiente para implicar una cepa como causante de un brote de
legionelosis. Por ello, resulta imprescindible tipificar las cepas
procedentes de los pacientes y las ambientales, mediante su estudio
genotípico. La epidemiología molecular es, en estos
casos, de gran interés para corroborar la hipótesis
establecida inicialmente y adoptar medidas de prevención
eficaces.
Para realizar estos estudios es imprescindible contar con
cultivos del mayor número posible de pacientes y con cultivos
del mayor número de instalaciones relacionadas posible. Se ha
demostrado la coexistencia de varias cepas Legionella diferentes
en una misma instalación, por lo que es importante identificar
al menos 5 ó 6 colonias de cada muestra analizada.
La genotipificación de los cultivos de los pacientes
define de manera precisa el tipo de Legionella que produce los
casos, siendo éste el que se busca entre los cultivos
ambientales. Para ello se comparan los cultivos humanos y ambientales
mediante técnicas de epidemiología molecular
(genotipificación).
Muchas han sido las técnicas utilizadas para discriminar
los aislados de Legionella: análisis de plásmidos,
electroforesis de proteinas (PAGE), análisis multienzimático,
digestión del ADN cromosómico (RFLP), digestión
del ADN cromosómico en combinación con hibridación
con sondas (ribotipificación), digestión del ADN cromosómico
con enzimas de restricción de corte poco frecuente (PFGE).
También se han utilizado diferentes tipos de amplificación
del ADN, como la amplificación arbitraria (AP-PCR), la
amplificación al azar (RAPD), o de regiones repetidas en el
cromosoma (REP-PCR), o de fragmentos intergénicos repetidos en
el cromosoma (ERIC). Otra técnica utilizada en la caracterización
molecular de Legionella es la combinación de la digestión
del ADN con la amplificación de los fragmentos de restricción
(AFLP), que además, cuenta con una base de datos europea a la
que se puede acceder (www.ewgli.org)
para la asignación de tipos.
Actualmente, la necesidad de disponer de métodos de
caracterización molecular que ofrezcan resultados rápidos
y reproducibles, con la posibilidad de ser compartidos en tiempo real
por diferentes laboratorios, ha llevado al desarrollo de métodos
de secuenciación de genes basados en técnicas de MLST (multilocus
sequence typing). Una variante de esta técnica es el SBT (sequence-based
typing) en la que se emplean tanto genes "housekeeping"
como genes devirulencia, y ha sido empleada para la tipificación
molecular de L. pneumophila serogrupo 1.
Los resultados obtenidos con el estudio de seis genes, flaA,
pilE, Asd, mip, mompS y proA, que son
los que se han empleado en el primer estudio piloto de SBT en el
EWGLI, son muy prometedores, existiendo actualmente una base de datos
a la que se puede acceder para la asignación de alelos
(www.ewgli.org).
Aunque los brotes de legionelosis pueden aparecer en distintos ámbitos
(hospitalario, comunitario o relacionado con viajeros) la estrategia
para la tipificación epidemiológica de los cultivos de
Legionella puede ser la misma. En la Figura 2 se detalla la estrategia
propuesta por el EWGLI para la investigación de brotes de
legionelosis asociados con viajes, basada en la combinación de
tipificación con anticuerpos monoclonales junto con un método
molecular.
6.4.8. Elaboración de un informe
Una vez cerrado el brote clínicamente y terminadas las
primeras investigaciones se debe elaborar un informe que incluya los
aspectos más relevantes y las primeras conclusiones,
independientemente de que algunas investigaciones parciales continúen.
Figura 2. Estrategia abordada por el EWGLI
para la tipificación epidemiológica de en la investigación
de legionelosis asociada a viajeros (Fry y cols. 1999)
- 7. BIBLIOGRAFÍA
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- 7.4 DETECCIÓN DE
ANTÍGENO EN ORINA
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Legionella EN MUESTRAS CLÍNICAS CON TÉCNICAS DE
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MOLECULAR DE L. pneumophila
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rocedimientos
en Microbiología Clínica
