Especies de Ehrlichia y Anaplasma

Vector

Distribución geográfica

E. canis

Riphicephalus sanguineus

Mundial

E. chaffeensis

Amblyomma americanum

Dermacentor variabilis

Norteamérica

Centroamérica

A. phagocytophilum

Ixodes ricinus

Europa

Norteamérica

Norte de África

E. ewingii

A. americanum

Norteamérica

E. sennetsu

Desconocido

Japón

Malasia

MUESTRA

Recogida

transporte Tiempo y temperatura

conservación Tiempo y temperatura

PRUEBA DIAGNÓSTICA

NOTA

Suero

Recoger en tubo de serología

<24 h, 2-8°C

+24h, -20°C

IFI¹

Sangre con EDTA

Recoger en tubo con EDTA

< 48 h, TA
+48h, - 20°C

+48h, - 20°C
(no varias descongelaciones)

PCR²

Sangre citratada

Recoger en tubo con citrato

< 48 h, TA
+48h, - 20°C

+48h, - 20°C
(no varias descongelaciones)

PCR²

Sangre heparinizada

Recoger en tubo con heparina

< 24h, TA
+ 24h, -80ºC

+24h, -80°C
(no varias descongelaciones)

Cultivo³

La heparina ⁴ puede inhibir la PCR

Anaplasmosis humana confirmada

1. Fiebre con antecedente de exposición o picadura de garrapata, y

2. Demostración de infección por Anaplasma phagocytophilum por seroconversión o aumento de cuatro veces el título de anticuerpos^a , o

3. Resultado de PCR positivo con posterior secuenciación de los amplicones demostrando ADN específico de Anaplasma en sangre, o

4. Aislamiento de A. phagocytophilum en cultivo de sangre

Probable anaplasmosis humana

1. Fiebre con antecedente de exposición o picadura de garrapata, y

2. Presencia de un título estable de anticuerpos frente a A. phagocytophilum en los sueros agudo y convaleciente si el título es 4 veces el punto de corte^a, o

3. Resultado de PCR positivo sin posterior secuenciación^b, o

4. Presencia de mórulas intracitoplasmáticas en frotis sanguíneo

MUESTRA

Recogida

transporte Tiempo y temperatura

conservación Tiempo y temperatura

PRUEBA DIAGNÓSTICA

NOTA

Suero

Tubo con tapón de rosca

<24 h, 2-8°C

+24h, -20°C

IFI¹

Sangre con EDTA

Recoger en tubo con EDTA

< 24 h, 2-8 ºC.

+24h, -20°C

PCR²

El EDTA³ dificulta el cultivo

Sangre citratada

Recoger en tubo con citrato

< 24 h, 2-8 ºC.

+24h, -60/-80°C (no varias descongelaciones)

PCR, Cultivo⁴

Sangre heparinizada

Recoger en tubo con heparina

< 24 h, 2-8 ºC.

+24h, -60/-80°C (no varias descongelaciones)

Cultivo

La heparina⁵ puede inhibir la PCR

LCR

Recoger en tubo estéril

< 24 h, 2-8 ºC.

+24h, -20°C

PCR

Biopsia cutánea

Se recomienda asepsia en la toma de la muestra. Colocar el tejido en un tubo o frasco estéril con suero fisiológico estéril para prevenir la desecación

<24 h, 2-8°C

+24 h, -20°C

Microscopía⁶

PCR

Muestra de la escara de inoculación

Contenido de pápulas/máculas

Recoger en tubo/torunda estériles

<24 h, 2-8°C

+24 h, -20°C

PCR

Manifestaciones Clínicas

Frecuentes (90-50%)

Pérdida de peso

Diarrea

Dolor Abdominal

Artralgias

Artritis

Fiebre de bajo grado

Adenopatías

Hiperpigmentacion de la piel

Menos frecuentes

SNC (20-30%)

Cambios cognitivos, demencia

Nivel de conciencia alterado

Manifestaciones hipotalámicas

Mioclonias

Ataxia

Miorritmia oculomasticatoria

Miorritmia oculofacial

CARDIOVASCULARES (35-65%)

Endocarditis

Pericarditis

Miocarditis

OFTALMOLÓGICAS (5-15%)

Uveitis

Retinitis

Queratitis

Neuritis óptica

Edema de papila

Vitritis

PULMONARES (30-40%)

Tos

Derrame pleural

Iniciador

Secuencia (5'-3') (forward/reverse)

Diana

Tamaño del producto (pb)

Referencias

W3FE

W2RB

f: GGAATTCCAGAGATACGCCCCCCGCAA

r: CGGGATCCCATTCGCTCCACCTTGCGA

16S rARN

284

Relman y cols 1992. N. Engl. J. Med. 327: 293-301

whipp-frw1

whipp-rev

f : TGA CGG GAC CAC AAC ATC TG

r : ACA TCT TCA GCA ATG ATA AGA AGT T

hsp65

1ª amplificación

500

Morgenneg y cols. 2000. J. Clin. Microbiol. 38: 2248-2253

whipp-frw2

whipp-rev

f : CGC GAA AGA GGT TGA GAC TG

r : ACA TCT TCA GCA ATG ATA AGA AGT T

hsp65

2ª amplificación

357

Twrpoß -F

Twrpoß -R

f::AAAAAGGCCGCACGCGAGTT

r: AAAGAGGCTCCAACGCCACG

rpoß

650

Drancourt y cols. 2001. J. Clin. Microbiol. 39: 2425-2430

TW27F

TW182R

27F-182R

f: TGTTTTGTACTGCTTGTAACAGGATCT

r:TCCTGCTCTATCCCTCCTATCATC

6-FAM-AGAGATACATTTGTGTTAGTTGTTACA-TAMRA

Secuencias repetidas

PCR tiempo real

Sonda Taqman

105

Raoult y cols. 2006.N. Eng. J. Med. 355: 1503-1505

TW704

TW899

TW795-ANCOR

TW817-RED640

f: AAAGAGGTTGAGACTG

r: ATCGGTTACAAAATAAGC

AGAAGGTTGGCAAGGAAGGC-FLUORESCEINA

LC-RED-640TGTCACTGTCGAGGAGTCAAATACT-FOSFATO

hsp65

PCR tiempo real

sondas FRET

213

Sloan y cols. 2005.J. Clin. Microbiol. 43: 3516-3518

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-01
AISLAMIENTO DE Anaplasma phagocytophilum A PARTIR DE MUESTRAS CLÍNICAS MEDIANTE CULTIVO

1. PROPÓSITO Y ALCANCE
El objeto de este procedimiento es describir la metodología de aislamiento de A. phagocytophilum a partir de muestras clínicas. Este procedimiento se lleva a cabo mediante cultivos celulares inoculados con muestras de pacientes en los que se sospecha una Anaplasmosis Humana (AH). Es aplicable a determinadas muestras clínicas que se reciben en los laboratorios clínicos siendo obligatorio disponer de un laboratorio de bioseguridad de nivel 3.

2. FUNDAMENTO

El diagnóstico de AH requiere el cumplimiento de criterios clínicos (síndrome febril, leucopenia, trombocitopenia, aumento de las enzimas hepáticas), antecedente de picadura de garrapata o posibilidad de la misma (ambiente epidemiológico apropiado) y la confirmación mediante pruebas diagnósticas.

A. phagocytophilum, agente causal de la AH, vive en el citoplasma de las células que infecta, agrupada en unas inclusiones denominadas mórulas que se pueden visualizar mediante tinición con colorantes Giemsa o Wright en extensiones de sangre, médula y LCR mediante microscopía convencional. No obstante, la visualización de las mórulas sólo permitiría establecer un diagnóstico de sospecha de AH, ya que también se observan en otras infecciones provocadas por Ehrlichia-Anaplasma. Además en la literatura europea estas técnicas tienen escaso rendimiento. El diagnóstico mediante técnicas de biología molecular tiene una baja rentabilidad y las pruebas serológicas disponibles para la detección de anticuerpos frente a A. phagocytophilum tienen la limitación de las reacciones cruzadas, la necesidad, en muchos casos, de un segundo suero en fase de convalecencia para demostrar una seroconversión y la no disposición de antígenos locales (ver PNTs de PCR e Inmunofluorescencia Indirecta de A. phagocytophilum). Todos estos factores hacen que el aislamiento de A. phagocytophilum en medios de cultivo sea la principal prueba diagnóstica. El gran problema es que no crece en los medios de cultivo habituales, siendo necesarias líneas celulares y un laboratorio de nivel de seguridad 3.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA

- Guidelines for the diagnosis of tick-borne bacterial diseases in Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. 2004. 10:1108-32.

- Laboratory Biosafety Manual (WHO, 2003).

- Manual de instrucciones de funcionamiento y mantenimiento de equipos del laboratorio (centrífuga, termociclador, estufa, etc.).

- Preparación de medios, reactivos y viales con cultivos celulares.

- Procedimiento del laboratorio sobre gestión de residuos.

- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 1a de "Recogida, transporte y procesamiento general de las muestras en el laboratorio de microbiología", 2003.

- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 10 de "Seguridad en el laboratorio de microbiología clínica", 2000.

- Protocolo del laboratorio de verificación y calibración de equipos e instrumentos.

4. MUESTRAS

4.1. TIPO DE MUESTRA, RECOGIDA, TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN

La muestra más adecuada para el cultivo de A. phagocytoplilum es la sangre recogida con heparina. Se recogerá según se indica en el Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 1a de "Recogida, transporte y procesamiento general de las muestras en el laboratorio de microbiología" (PNT-RTP-01. 2003). Las muestras se deben recoger en contenedores estériles de un solo uso con cierre hermético y enviarse, a ser posible, el mismo día de la extracción y sin congelar. Si el envío no se va a realizar de manera inmediata, conviene congelar a -80ºC hasta su envío, que debe llevarse a cabo en hielo seco para prevenir la descongelación.

4.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

En términos generales, el procedimiento utilizado para el procesamiento de estas muestras es el habitual del laboratorio de microbiología. Las muestras deben manejarse como potencialmente peligrosas. Cuando una muestra se recibe en el laboratorio, y antes de procesarse, debe someterse a una inspección previa para asegurarse que ha sido bien seleccionada, recogida y transportada. Las muestras se rechazarán en los siguientes casos: 1) muestra no identificada, 2) transporte inadecuado o demasiado prolongado, 3) muestra derramada, 4) cantidad insuficiente. Las muestras inaceptables no deben procesarse y el médico debe ser informado inmediatamente. En estos casos, se contactará con el médico solicitante para pedir una nueva muestra.

Los consejos generales para optimizar el procesamiento de muestras son:

1. Comprobar que el etiquetado de la muestra es correcto.

2. Registrar toda la información necesaria que pudiera afectar a la calidad de la muestra que represente algún interés diagnóstico así como aspectos relacionados con su recogida, transporte y conservación.

3. Durante el procesamiento, deben seguirse todas las medidas de seguridad necesarias, tanto para el personal como para la muestra.

4. El procesamiento debe llevarse a cabo tan pronto como sea posible garantizando de esta forma la viabilidad del patógeno.

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y PRODUCTOS

- Línea celular HL60 (ATCC CCL-240)

- Medio de cultivo: Minimum essential medium (MEM) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (SBF) y 2 mM. de L-glutamina

- Tripsina

- Tampón fosfato salino (PBS) de pH 7,2 estéril.

6. APARATOS Y MATERIALES

- Cabina de flujo laminar vertical de nivel de bioseguridad clase II.

- Centrífuga con adaptadores para viales que alcance una velocidad de 3.000 rpm.

- Estufa convencional.

- Pipetas Pasteur estériles.

- Micropipetas de varios volúmenes.

- Puntas de micropipeta.

- Pipetas de 5 y 10 ml estériles.

- Frascos de cultivo Falcon de 25 cm².

7. PROCEDIMIENTO

1. Obtención de la capa leucocitaria a partir de la muestra de sangre total con heparina: centrifugar la muestra a 1.000 rpm durante 2-3 min. y recoger el plasma de la zona más próxima a la capa de glóbulos rojos que queda al fondo. Posteriormente, hacer una segunda centrifugación a 3.000 rpm durante 5 min. y recoger lo que se ha sedimentado.

2. Inoculación de la capa leucocitaria en 3 ml de la línea celular HL60 (ajustada a una densidad de 500.000 células/ml).

3. Incubación de las células (densidad de 200.000 a 600.000 células/ml) a 37ºC. Dos veces por semana se debe retirar el medio y añadir 5 ml de medio de cultivo fresco.

4. El cultivo puede ser positivo entre los 5 y 12 días después de la inoculación. La identificación de los aislamientos se comprueba mediante la detección de las mórulas teñidas con tinciones de Giemsa o Wright o con técnicas de biología molecular (PCR y secuenciación).

8. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

1. Limitaciones propias de los cultivos celulares, como múltiples contaminaciones o rotura de la monocapa.

2. El cultivo de A. phagocytophilum, resulta muy laborioso y se requiere personal especializado e instalaciones con nivel de seguridad 3, por lo que su realización queda limitada a los laboratorios que cumplan estos requisitos.

3. Existe un gran número de variantes de A. phagocytophilum, algunas de ellas descritas en nuestro medio, que no se han podido cultivar en esta línea celular.

9. BIBLIOGRAFÍA

1. Blanco JR, Oteo JA. Human granulocytic ehrlichiosis in Eur J Clin Microbiol Infect 2002; 8:763-772.

2. Brouqui P, Bacellar F, Baranton G, et al. Guidelines for the diagnosis of tick-borne bacterial diseases in Eur J Clin Microbiol Infect 2004; 10:1108-1132.

3. Dawson JE, Anderson BE, Fishbein DB, et al. Isolation and characterization of an Ehrlichia sp. from a patient diagnosed with human ehrlichiosis. J Clin Microbiol 1991; 29:2741-2745.

4. Goodman JL, Nelson C, Vitale B, et al. Direct cultivation of the causative agent of human granulocytic ehrlichiosis. N Engl J Med 1996; 334:209-15. Erratum in: N Engl J Med 1996; 335:361. 5. Massung RF, Levin ML, Munderloh UG, et al. Isolation of Anaplasma phagocytophilum strain Ap-variant 1 in a tick-derived cell line. Ann N Y Acad Sci 2006; 1078:541-544.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-02
DIAGNÓSTICO DE ANAPLASMOSIS HUMANA MEDIANTE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)

1. PROPÓSITO Y ALCANCE
El objeto de este procedimiento es detectar anticuerpos frente a A. phagocytophilum a partir de muestras de suero humano mediante la técnica de inmunofluorescencia indirecta.

2. FUNDAMENTO

La técnica de IFI permite detectar anticuerpos en el suero del paciente, al visualizar, en un microscopio de fluorescencia, la luz emitida por una molécula fluorescente conjugada a un anticuerpo anti-inmunoglobulina G humana que se encuentra unido al complejo antígeno-anticuerpo, formado por la unión de los anticuerpos presentes en el suero del paciente con el antígeno prefijado en un portaobjetos. La técnica tiene lugar en dos etapas: en un primer paso, se enfrenta el suero del paciente, diluido en tampón fosfato salino (PBS) con el antígeno fijado en un portaobjetos. Tras una incubación en determinadas condiciones de humedad y temperatura, que facilitan la unión específica del antígeno-anticuerpo, se realizan unos lavados que eliminarán los anticuerpos no específicos que no se han unido al antígeno. En un segundo paso, se añade un anticuerpo anti-inmunoglobulina humana marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC), este anticuerpo se unirá al anticuerpo que ya se encuentra unido al antígeno. Al observar el portaobjetos con un microscopio de fluorescencia, la luz incide sobre la FITC emitiendo una luz de color verde manzana que nos permite detectar la presencia de anticuerpos.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA

- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 1a de "Recogida, transporte y procesamiento general de las muestras en el laboratorio de microbiología", 2003.

- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 10 de "Seguridad en el laboratorio de microbiología clínica", 2000.

4. MUESTRAS

4.1. TIPO DE MUESTRA, RECOGIDA, TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN

La muestra de elección para el diagnóstico de anaplasmois humana (AH) es el suero. Éste se recoge según se indica en el Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 1ª (Recogida, transporte y procesamiento general de muestras en el laboratorio de microbiología, PNT-RTP-0, 2003), y se envía en contenedores estériles de un solo uso y con cierre hermético. El suero debe enviarse refrigerado lo antes posible. Si el envío no se va a realizar de manera inmediata, conviene congelarlo a -20ºC hasta su envío, el cual deberá llevarse a cabo en hielo seco para prevenir su descongelación.

4.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS:

En términos generales, el procedimiento utilizado para el procesamiento de estas muestras es el habitual del laboratorio de microbiología. Cuando una muestra se recibe en el laboratorio, y antes de procesarse, debe someterse a una inspección previa para asegurarse que ha sido bien seleccionada, recogida y transportada. Las muestras se rechazarán en los siguientes casos: 1) muestra no identificada, 2) transporte inadecuado o demasiado prolongado, 3) muestra derramada, 4) cantidad insuficiente. Además de estos casos, no se aceptará suero hemolítico ni hiperlipémico. Las muestras inaceptables no deberán procesarse y el médico deberá ser informado inmediatamente. En estos casos, se contactará con el médico solicitante para pedir una nueva muestra.

Los consejos generales para optimizar el procesamiento de las muestras son:

1. Comprobar que el etiquetado de la muestra es correcto.

2. Registrar toda la información necesaria que pudiera afectar a la calidad de la muestra y que represente interés diagnóstico así como aspectos relacionados con su recogida, transporte y conservación.

3. Durante el procesamiento, deben seguirse todas las medidas de seguridad necesarias, tanto para el personal que lleva a cabo la manipulación como para la muestra.

Puesto que resulta importante realizar estudios cuantitativos de sueros del mismo paciente a lo largo del tiempo, es fundamental conservar una alícuota congelada a -20ºC de cada muestra que se analice para poder realizar en paralelo el estudio comparativo con las diferentes muestras.

5. REACTIVOS, PRODUCTOS, APARATOS Y MATERIAL NECESARIO

5.1. REACTIVOS Y PRODUCTOS

- Portaobjetos con celdas de antígeno prefijado: cada celda contiene células inactivadas e infectadas por A. phagocytophilum (Focus Diagnostics).

- Conjugado de anticuerpos anti-inmunoglobulinas humanas macadas con fluoresceína: Se encuentra ya preparado comercialmente (varios proveedores) o se puede preparar en el momento de uso (adición de inmunoglobulinas anti-IgG humanas a una dilucción 1:100 de azul de evans en PBS).

- Medio de montaje: contiene glicerol tamponado con PBS a pH de 7,2.

- PBS: un frasco de solución salina tamponada de fosfato en polvo. Se reconstituye con 1 litro de agua destilada (o purificada).

La solución reconstituida es tampón a 0,01 M de pH 7,2. Estos reactivos han de conservarse refrigerados entre 2 y 8°C.

5.2. APARATOS

- Estufa.

- Microscopio de fluorescencia.

- Nevera de 2 a 8°C

5.3. MATERIALES

- Tubos de plástico, fondo cónico tipo Eppendorf de 1,5 ml.

- Gradillas.

- Placas de microdilución .

- Micropipetas de varios volúmenes (20 µL, 200 µL, 1000 µL).

- Puntas para micropipetas.

- Vortex.

- Botella Pyrex con tapón de rosca de 1.000 ml para la preparación de PBS, y almacenamiento del tampón sobrante.

- Jarra coplin o frasco lavador para el tampón.

- Cubreobjetos de 20 x 50 mm.

- Cámara húmeda para la incubación de los portas.

- Agua destilada o purificada

- Reloj

- Papel absorbente para secar las láminas

- Controles positivo y negativo. Existen ya comercializados (Focus diagnostics) o bien se utilizan sueros diagnosticados de AH (control positivo) o diagnosticados de otras infecciones (control negativo) disponibles en el laboratorio.

6. PROCEDIMIENTO

-1. Antes de comenzar la técnica se deben sacar los reactivos de la nevera para que se atemperen.

2. Preparar la dilución de ensayo del suero 1/64 (por ejemplo: 5 µL del suero del paciente en 315 µL de PBS). Si se quiere titular la muestra preparar diluciones seriadas en PBS utilizando la placa de microdiluciones (1/128, 1/256, 1/512, 1/1024…).

3. Preparar un esquema de las celdas del portaobjetos donde aparezca en que posición va a estar situado cada suero del paciente y su dilución correspondiente, así como la posición de los controles.

4. Añadir 25 µL de los sueros, del control negativo y del positivo en las celdas correspondientes.

5. Incubar los portaobjetos en cámara húmeda a 37°C durante 30 minutos.

6. Retirar los portaobjetos de la cámara húmeda y enjuagar con PBS. A continuación, sumergirlos en una jarra tipo Coplin con PBS 10 minutos.

7. Lavar en agua destilada o purificada y dejar que se sequen al aire.

8. Añadir aproximadamente 25 µL de conjugado a cada celda.

9. Incubar las láminas en cámara húmeda a 37°C durante 30 minutos.

10. Repetir los pasos de lavado 6 y 7.

11. Poner unas gotas de medio de montaje en la lámina y cubrir con un cubreobjetos de 20 x 50 mm.

12. Examinar las celdas con un aumento final de 400X con un microscopio de fluorescencia equipado correctamente. Leer los portaobjetos el mismo día que se realiza la prueba para que la fluorescencia sea óptima. Si esto no fuese posible, guardar las láminas en la oscuridad de 2 a 8°C hasta 24 horas.

7. CONTROL DE CALIDAD

En cada serie se deben incluir controles positivos y negativos.

1. En el control positivo se deben observar inclusiones de fluorescencia intensa y brillante de color verde manzana sobre las células que aparecen en un color rojo oscuro.

2. En el control negativo no se debe ver fluorescencia o esta debe tener una reactividad insignificante. La fluorescencia que no empareja la morfología y la distribución del control positivo se considera negativa.

Si los controles no exhiben estos resultados, los resultados de las muestras del paciente deben ser considerados inválidos y la prueba deberá repetirse.

8. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

La óptica del microscopio y la condición y el tipo de fuente de luz determinan la intensidad fluorescente total y los títulos finales. En cada determinación se deben leer primero las celdas control para asegurar la interpretación correcta.

Lectura de los portaobjetos: La fluorescencia se valora de la forma siguiente: Positiva de 2 a 4+: fluorescencia verde manzana moderada a intensa. Positiva de 1+: fluorescencia equivalente a la observada en el título final de referencia del control positivo. Negativa: no hay fluorescencia o es igual a la observada en la celda del control negativo (o menor que la del título final).

Interpretación de resultados de las muestras del paciente: La inversa de la dilución de suero más alta que exhibe fluorescencia verde manzana (1+) se denomina el título final de suero.

>1:64: Títulos finales de anticuerpos IgG séricos de >1:64 sugieren infección en época indeterminada y pueden ser indicativos de una infección anterior o de una respuesta temprana a una infección reciente.

<1:64: No se han detectado anticuerpos.

Una seroconversión o aumento del título de, al menos, cuatro veces entre dos muestras de suero obtenidas de 1 a 2 semanas después y evaluadas en paralelo junto a los antecedentes epidemiológicos y una clínica compatible permite establecer el diagnostico de AH.

9. BIBLIOGRAFÍA

1. Brouqui P, Salvo E, Dumler JS, et al. Diagnosis of granulocytic ehrlichiosis in humans by immunofluorescence assay. Clin Diagn Lab Immunol 2000; 8:199-202.

2. Guerrero A, Losada I, De Lucas S, et al. Ehrlichiosis infection prevalence in Spain or cross-reactions. Med Clin (Barc) 2001; 116:315.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-03
DETECCIÓN DIRECTA DE Anaplasma phagocytophilum EN MUESTRAS CLÍNICAS MEDIANTE AMPLIFICACIÓN GENÓMICA (PCR) Y SECUENCIACIÓN

1. PROPÓSITO Y ALCANCE
El objeto de este procedimiento es describir la metodología de detección de Anaplasma phagocytophilum (anteriormente denominado Ehrlichia phagocytophila) en muestras clínicas mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) convencional y posterior secuenciación del producto amplificado. Este procedimiento es aplicable a todas las muestras clínicas con sospecha de anaplasmosis que se reciben en los laboratorios de microbiología clínica que realicen diagnóstico molecular. También es aplicable al ADN extraído a partir de cultivos infectados con muestras clínicas (ver el PNT-EMG-01: Aislamiento de A. phagocytophilum a partir de muestras clínicas mediante cultivo).

2. FUNDAMENTO

Las técnicas moleculares son un instrumento valioso para el diagnóstico etiológico de anaplasmosis, ya que pueden detectar en poco tiempo el genoma de cualquier patógeno potencial, independientemente de la viabilidad del microorganismo. Estas técnicas se ven menos afectadas que los cultivos por los tratamientos antibióticos previos, aunque también pueden disminuir la sensibilidad. La obtención de los resultados es mucho más rápida en comparación con el cultivo y tienen alta sensibilidad y especificidad. Por el momento, la mayor parte de las técnicas descritas son de desarrollo propio (in house), no estando comercializadas. Aunque existe una gran cantidad de dianas descritas, el gen ARNr 16S es una de las más comúnmente utilizadas puesto que está presente en el genogrupo de A. phagocytophilum (que incluye las especies anteriormente denominadas E. phagocytophila, Ehrlichia equi y agente de la ehrlichiosis humana granulocítica (HGE)). Otra diana que ha demostrado gran capacidad de detección es la del gen repetido en múltiples copias msp2 (hge-44 o p44), que codifica una proteína de superficie inmunodominante de 40-49kDa de A. phagocytophilum. Dado que en pacientes que hayan sido picados por garrapatas fuera de Europa se puede adquirir una infección por Ehrlichia chaffeensis u otra especie, con estas muestras se pueden utilizar otras dianas que permitirían la amplificación de todas las Ehrlichiae (fD1 y rP2).

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA

- Guidelines for the diagnosis of tick-borne bacterial diseases in Europe. Clin Microbiol Infect 10:1108-1132.

- Laboratory Biosafety Manual (WHO, 2003).

- Manual de instrucciones de funcionamiento y mantenimiento de equipos (centrífuga, baño, termociclador, centrífuga de vacío, fuente y cubetas de electroforesis) del laboratorio.

- Procedimiento del laboratorio sobre Gestión de residuos.

- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 1a de "Recogida, transporte y procesamiento general de las muestras en el laboratorio de microbiología", 2003.

- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 10 de "Seguridad en el laboratorio de microbiología clínica", 2000.

- Protocolo del laboratorio de verificación y calibración de equipos e instrumentos.

4. MUESTRAS

4.1. TIPO DE MUESTRA, RECOGIDA, TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN

La muestra más adecuada para el diagnóstico molecular de A. phagocytophilum es la capa leucocitaria obtenida de sangre en fase aguda extraída con EDTA o citrato. Para ello se recomienda centrifugar la muestra a 1.000 rpm durante 2-3 min. y recoger el plasma de la zona más próxima a la capa de glóbulos rojos que queda al fondo. Posteriormente, hacer una segunda centrifugación a 3.000 rpm. durante 5 min. y recoger lo que se ha sedimentado. El procesamiento de la muestra debe realizarse siempre lo más rápidamente posible; ésta puede mantenerse a temperatura ambiente durante las primeras 48 h o congelarse a -20ºC si se supera ese tiempo. Se recogerá según se indica en el Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 1a de "Recogida, transporte y procesamiento general de las muestras en el laboratorio de microbiología". PNT-RTP-01. 2003. Las muestras se deben recoger y enviar en contenedores estériles de un solo uso y con cierre hermético.

4.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS:

En términos generales, el procedimiento utilizado para el procesamiento de estas muestras es el habitual del laboratorio de microbiología. Las muestras deben manejarse como si tuvieran microorganismos potencialmente peligrosos. Cuando una muestra se recibe en el laboratorio, y antes de procesarse, debe someterse a una inspección previa para asegurarse que ha sido bien seleccionada, recogida y transportada. Las muestras se rechazarán en los siguientes casos: 1) muestra no identificada, 2) transporte inadecuado o demasiado prolongado, 3) muestra derramada, 4) cantidad insuficiente. Las muestras inaceptables no deben procesarse y el médico debe ser informado inmediatamente. En estos casos, se contactará con el médico solicitante para pedir una nueva muestra.

Los consejos generales para optimizar el procesamiento de muestras son:

1. Comprobar que el etiquetado de la muestra es correcto.

2. Registrar toda la información necesaria que pudiera afectar a la calidad de la muestra y que represente interés diagnóstico así como aspectos relacionados con su recogida, transporte y conservación.

3. Durante el procesamiento, deben seguirse todas las medidas de seguridad necesarias, tanto para el personal como para la muestra.

4. El procesamiento debe llevarse a cabo tan pronto como sea posible garantizando de esta forma la estabilidad del ADN del patógeno.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS

5.1. REACTIVOS PARA LA EXTRACCIÓN DE ADN

Se utilizará el kit "QIAamp DNA Blood" (QIAGEN, Hilden, Germany), para la extracción de ADN a partir de muestras de sangre.

5.2. REACTIVOS PARA LA AMPLIFICACIÓN

(volumen de reacción: 50 µL).

Concentración final en la reacción:

- 1x de tampón de reacción NH₄

- 3 mM de MgCl₂ (en ocasiones, puede recurrirse a optimizar la cantidad de MgCl₂, modificando su concentración en un rango entre 1-6 mM).

- 0,2 mM de la mezcla de 4 dinucleótidos trifosfato (dNTPs) (varios proveedores).

- Oligonucleótidos 50 pmol de cada uno de ellos:

Para el gen rrs de A. phagocytophilum:

ge9f: 5'-AACGGATTATTCTTTATAGCTTGCT-3'

ge10r: 5'-TTCCGTTAAGAAGGATCTAATCTCC-3'

Para el gen msp2 de A. phagocytophilum:

msp2-3F: 5´-CCAGCGTTTAGCAAGATAAGAG-3´

msp2-3R: 5´-GCCCAGTAACAACATCATAAGC-3´

Para el gen rrs de todas las Ehrlichiae:

fD1: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

rP2: 5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'

- 1,5 U Taq polimerasa (varios proveedores).

5.3. REACTIVOS PARA LA ELECTROFORESIS

- Tampón TBE 1x (Tris-HCl 100 mM, ácido bórico 90 mM, Na₂EDTA.2H₂O 1 mM; pH 8,3).

- Tampón de carga para electroforesis (azul de bromofenol 0,25%, cianol xileno FF 0,25%, glicerol 30%).

- Marcador de tamaño molecular de intervalo 100-1.000 pb (varios proveedores).

- Agarosa "Low Melting" (varios proveedores).

- Bromuro de etidio (10 mg/ml).

- Agua destilada.

5.4. REACTIVOS PARA LA PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO AMPLIFICADO

Se utilizará el kit "QUIAquick gel extraction" (QIAGEN).

5.5. REACTIVOS PARA LA SECUENCIACIÓN

Se utilizará el kit "BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing v2.0 Ready Reaction" Applied Biosystems (USA).

6. APARATOS Y MATERIALES

6.1. INSTRUMENTAL

- Cabina de Seguridad Biológica de clase IIA.

- Centrífuga de sobremesa con rotor oscilante para centrifugar tubos de sangre

- Microcentrífuga para tubos de fondo tipo Eppendorf y rotor angular, con velocidad de rotación de 16.000 x g.

- Agitador orbital tipo vortex.

- Bloques de calor seco o termobloques.

- Termociclador.

- Balanza de precisión.

- Espectrofotómetro.

- Microondas para fundir la agarosa.

- Cubetas de electroforesis.

- Fuente de alimentación para electroforesis convencional.

- Transiluminador de luz U.V.

- Equipo fotográfico o de captación de imágenes.

- Nevera (2-8°C).

- Congelador (-20°C).

6.2. MATERIALES

- Tubos tipo Eppendorf de 1,5 y 0,2 ml.

- Gradillas de diferentes formatos.

- Gradillas congeladora (-20°C) y refrigeradora (2-8°C).

- Cajas de congelación para tubos Eppendorf.

- Micropipetas de diferentes volúmenes

- Puntas de micropipeta estériles provistas de filtro a prueba de aerosoles.

- Tubo Vacutainer con anticoagulante EDTA o citrato para extracción de la sangre.

- Botellas esterilizadas mediante calor seco para preparar tampones y geles de agarosa.

7. PROCEDIMIENTO

7.1. EXTRACCIÓN DEL ADN.

Para la extracción de ADN de las muestras se utilizará el "kit QIAamp DNA Blood" para sangre siguiendo las instrucciones del fabricante.

7.2. AMPLIFICACIÓN.

7.2.1. Controles necesarios:

- Control positivo: ADN de A. phagocytophilum a una dilución límite de detección para comprobar la eficacia de la amplificación de la PCR.

- Control negativo de extracción: extraer una muestra de agua en las mismas condiciones y a la vez que se extraen las muestras para analizar. Este control permite comprobar la ausencia de contaminaciones durante el proceso de extracción.

- Control negativo de PCR sin cebadores.

- Control negativo de PCR sin ADN: Se amplifica una muestra del agua estéril. Estos dos controles últimos permiten comprobar la ausencia de contaminaciones durante el proceso de amplificación.

- Para confirmar que el ADN se ha extraído correctamente y que no existen inhibidores en la muestra que impidan el proceso de amplificación, debe amplificarse en cada una de las muestras un control interno, por ejemplo el de la betaglobina que amplifica un fragmento de 150 pb (cebadores: sense-CATGCCTCTTTGCACCATTC y antisense-TGGTAGCTGGATTGTAGCTG).

7.2.2. Condiciones de la PCR del gen rrs de A. phagocytophilum:

- Un ciclo de desnaturalización a 95ºC durante 3 min.

- 35 ciclos de los siguientes pasos:

1. Desnaturalización a 94ºC durante 30 s.

2. Hibridación a 55ºC durante 30 s.

3. Extensión a 72ºC durante 1 min.

- Un ciclo para completar la extensión de los productos de PCR. Consiste en una incubación a 72ºC durante 5 min.

Condiciones de la PCR del gen msp2 de A. phagocytophilum:

- Un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 4 min.

- 40 ciclos de los siguientes pasos:

1. Desnaturalización a 94ºC durante 30 s.

2. Hibridación a 56ºC durante 30 s.

3. Extensión a 72ºC durante 30 s.

- Un ciclo para completar la extensión de los productos de PCR. Consiste en una incubación a 72ºC durante 1 min.

Condiciones de la PCR del gen rrs de Ehrlichiae:

- Un ciclo de desnaturalización a 95ºC durante 15 min.

- 40 ciclos de los siguientes pasos:

1. Desnaturalización a 94ºC durante 30 s.

2. Hibridación a 53ºC durante 30 s.

3. Extensión a 72ºC durante 90 s.

- Un ciclo para completar la extensión de los productos de PCR. Consiste en una incubación a 72ºC durante 3 min.

7.3. ELECTROFORESIS.

- Preparar el gel de agarosa al 0,8% en tampón TBE 1x.

- Cargar el gel, añadiendo previamente el tampón de carga a las muestras. Utilizar uno de los pocillos para cargar el marcador de tamaño molecular.

- Conectar la fuente de electroforesis de manera que no se sobrepasen 5 V/cm (considerando la distancia más corta entre los electrodos). Lo habitual es que se conecte a 100-150 V.

- Desconectar la fuente cuando el colorante azul de bromofenol esté aproximadamente a la mitad del gel (aproximadamente 1 hora). Para visualizar los amplicones, depositar el gel sobre un transiluminador con luz ultravioleta en un lugar oscuro.

7.4. LECTURA E INTERPRETACIÓN

Para validar los resultados del ensayo, en la carrera del control negativo no debe aparecer ninguna banda y en la del control positivo debe aparecer una banda de 919 pares de bases (pb) para el gen rrs y una banda de 334pb para msp2 de A. phagocytophilum y de 1500 pb para los cebadores universales. Para poder interpretar si ha habido amplificación en la muestras, debe aparecer en cada una de ellas la banda correspondiente al amplificado de control interno.

7.5. PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO AMPLIFICADO Y SECUENCIACIÓN

El producto amplificado se purifica cortando la banda a partir del gel de agarosa y utilizando el kit QUIAquick gel extraction kit, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Posteriormente, se somete a una nueva amplificación con concentraciones limitantes de dideoxinucleótidos marcados (secuenciación unidireccional). Se utiliza el kit "BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing v2.0 Ready Reaction" con los mismos oligonucleótidos que los usados en la fase de amplificación, a razón de 3 pmol por reacción de secuencia. Mediante el empleo de un secuenciador automático los amplificados se resuelven mediante electroforesis capilar, obteniéndose un cromatograma con la secuencia de bases. Finalmente, la secuencia de ácidos nucleicos se edita y se compara, mediante el empleo de un software específico, programas de alineamiento utilizando secuencias de referencia o bien mediante comparación on line con secuencias de bases de datos (programa Blast) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Los resultados de PCR se expresan en términos cualitativos de positivo o negativo. Los datos de secuencia permiten identificar las posibles mutaciones puntuales de las diferentes variantes de A. phagocytophilum que parecen tener diferente carácter patógeno o no patógeno para humanos.

Cuando se notifica un resultado de PCR negativo se debe tener en cuenta que, en ocasiones, la carga bacteriana en algunas muestras suele ser muy baja y por tanto los métodos moleculares pueden no ser suficientemente sensibles, por lo que un resultado negativo no descarta una infección.

9. RESPONSABILIDADES

Básicamente son las siguientes:

- Personal del área de recogida y procesamiento de muestras: recepción, identificación y procesamiento de las muestras, rechazo de las muestras remitidas en condiciones defectuosas y adopción de medidas correctoras.

- Personal técnico: control de las muestras, solicitudes y hojas de trabajo, realización de la técnica, lectura y registro de resultados, archivo de hojas de trabajo.

- Facultativo responsable: supervisión del trabajo y de los resultados, resolución de dudas técnicas, adopción de medidas correctoras en el caso de que se hayan cometido errores, firma del informe de resultados.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO

En el caso de la amplificación del gen rrs, la secuenciación del producto amplificado permite diferenciar variantes de A. phagocytophilum. Existen otros muchos genes comúnmente analizados como los genes ankA (epank1), groESL, rpoB o gltA (véase tabla 1).

Tabla 1. Genes utilizados como diana para la detección de A. phagocytophilum mediante PCR, secuencia de cebadores y tamaño del fragmento amplificado en cada caso.

f: forward; r: reverse.
* PCR anidada

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Si bien la PCR es una prueba ideal para el diagnóstico de estas infecciones, existen algunas desventajas en comparación con el cultivo, como son la limitación para realizar pruebas de sensibilidad a los antibióticos y la imposibilidad de coleccionar los aislados para futuras investigaciones. Se deben establecer algunos parámetros antes de incorporar estas pruebas a los protocolos de diagnóstico clínico de los hospitales, como por ejemplo definir el control interno de inhibición, sensibilidad, especificidad y reproducibilidad de la técnica.

12. BIBLIOGRAFÍA

1. Brouqui P, Bacellar F, Baranton G, et al. Guidelines for the diagnosis of tick-borne bacterial diseases in Europe. Clin Microbiol Infect 2004; 10:1108-1132.

2. Chen SM, Dumler JS, Bakken JS, et al. Identification of granulocytotropic Ehrlichia species as the etiologic agent of human disease. J Clin Microbiol 1994; 32:589-595.

3. Dumler JS, Brouqui P. Molecular diagnosis of human granulocytic anaplasmosis. Expert Rev Mol Diagn 2004; 4:559-569.

4. Inokuma H, Brouqui P, Drancourt M, et al. Citrate synthase gene sequence: a new tool for phylogenetic analysis and identification of Ehrlichia. J Clin Microbiol 2001; 39:3031-3039.

5. Massung RF, Mauel MJ, Owens JH, et al. Genetic variants of Ehrlichia phagocytophila, Rhode Island and Connecticut. Emerg Infect Dis 2002; 8:467-472.

6. Massung RF, Priestley RA, Miller N, et al. Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice. J Infect Dis 2003; 188:1757-1763.

7. Portillo A, Santos AS, Santibáñez S, et al. Detection of a non-pathogenic variant of Anaplasma phagocytophilum in Ixodes ricinus from La Rioja, Spain. Ann N Y Acad Sci 2005; 1063:333-336.

8. Stuen S, Van de Pol I, Bergström K, et al. Identification of Anaplasma phagocytophila (formerly Ehrlichia phagocytophila) variants in blood from sheep in Norway. J Clin Microbiol 2002; 40:3192-3197.

9. Sumner JW, Nicholson WL, Massung RF. PCR amplification and comparison of nucleotide sequences from the groESL heat shock operon of Ehrlichia species. J Clin Microbiol 1997; 35:2087-2092.

10. Taillardat-Bisch AV, Raoult D, Drancourt M. RNA polymerase beta-subunit-based phylogeny of Ehrlichia spp., Anaplasma spp., Neorickettsia spp. and Wolbachia pipientis. Int J Syst Evol Microbiol 2003; 53:455-458.

11. Walls JJ, Caturegli P, Bakken JS, et al. Improved sensitivity of PCR for diagnosis of human granulocytic ehrlichiosis using epank1 genes of Ehrlichia phagocytophila-group ehrlichiae. J Clin Microbiol 2000; 38:354-356.

12. Zeidner NS, Burkot TR, Massung R. Transmission of the agent of Human Granulocytic Ehrlichiosis by Ixodes spinipalpis ticks: Evidence of an enzootic cycle of dual infection with Borrelia burgdorferi in Northern Colorado. J Infect Dis 2000; 182:616-619.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-04
DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR Bartonella spp. A PARTIR DE MUESTRAS CLÍNICAS MEDIANTE CULTIVO

1. PROPÓSITO Y ALCANCE
El objetivo de este documento es describir el procesamiento de muestras para el diagnóstico microbiológico de la infección por Bartonella spp. mediante cultivo bacteriológico. Se documentan los tipos de muestra, su procesamiento en el laboratorio, las condiciones de cultivo y los métodos de identificación.

2. FUNDAMENTO

Las bartonellas son bacterias gramnegativas, pleomórficas y de difícil aislamiento. Estan relacionadas principalmente con la enfermedad por arañazo de gato, angiomatosis bacilar, peliosis hepática, bacteriemias, uveítis, endocarditis entre otras manifestaciones clínicas. Su aislamiento en cultivo, además de su utilidad para el diagnóstico microbiológico de la infección, posibilita el tipado de cepas para fines epidemiológicos y para estudios de sensibilidad.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA

- Gestión de residuos.

- Normas de bioseguridad: la situación del personal y las medidas a tomar frente a los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos regulados por el Real decreto (RD) 664/97 y la adaptación contenida en la orden de 25 de marzo de 1998.

- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 10 de "Seguridad en el laboratorio de microbiología clínica", 2000.

4. MUESTRAS

4.1 PETICION

La petición que acompaña a cada muestra debe estar estrictamente cumplimentada y en ella deberá constar el número de historia, nombre, edad, servicio de procedencia, tipo de muestra (de forma muy especifica), tratamiento previo, así como el diagnóstico clínico.

4.2 RECOGIDA DE LA MUESTRA.

Las muestras más utilizadas para el cultivo microbiológico de Bartonella spp. son las biopsias (ganglios o adenopatías, válvulas cardíacas, piel, etc.) y el hemocultivo (pacientes inmunodeprimidos o con sospecha de endocarditis).

4.3 TRANSPORTE Y CONSERVACION DE LAS MUESTRAS

Las biopsias deberán obtenerse de manera aséptica para poder evitar posibles contaminaciones y se transportaran al laboratorio con agua destilada lo más rápidamente posible. El cultivo se realizará inmediatamente o se conservaran a -80ºC para su procesamiento posterior. Los cultivos de sangre se inocularán directamente en una botella de hemocultivo para ser procesados en un sistema automático durante al menos 21 días. También se puede cultivar la sangre directamente en medios sólidos, siempre que se realice el proceso de lisis de los hematíes, para ello se recogerá la sangre en un tubo con EDTA y se congelará a -80ºC durante al menos 24 horas antes de sembrarse en el medio sólido.

4.4 CRITERIOS DE RECHAZO

Cualquier error en la identificación de la muestra: etiquetado erróneo o inadecuado, falta de información; mala conservación (temperatura inapropiada, muestra en medios incorrectos); muestras con aspecto de mala conservación (biopsias secas). Todas estas incidencias deben ser comunicadas al clínico, indicando el no procesamiento de las muestras y los posibles errores en la interpretación de resultados si se realiza.

5. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

5.1 MEDIOS DE CULTIVO

Agar Columbia con 5% de sangre de cordero, Agar chocolate con 1% de isovitalex y botellas de hemocultivos (del sistema que cada laboratorio utilice). Todos los medios deben estar conservados entre 2-8ºC hasta la fecha de caducidad indicada.

5.2 REACTIVOS

Colorantes para tinción Gram, reactivos para la realización de la oxidasa, catalasa.

6. APARATOS Y MATERIALES

Neveras, cabina de seguridad biológica, congelador de -80ºC, asas de siembra, morteros, guantes, mechero incinerador o Bunsen, centrífugas, portaobjetos.

7. PROCEDIMIENTO

7.1 PREPARACION E INOCULACION DE LA MUESTRA

Las biopsias se trituran en un mortero con 0,5 ml de agua destilada, y posteriormente se inoculan de 2 a 4 gotas del triturado en las placas de cultivo (agar sangre y agar chocolate) y se realizan estrías con el asa por toda la superficie de la placa. Las muestras de sangre con EDTA después de un proceso de congelación a -80ºC durante al menos 24 horas se sembraran en medios sólidos. Como alternativa para la lisis de la sangre se puede utilizar el método Isolator™ blood-lysis tube.

La sangre inoculada en botellas para su procesamiento automatizado se incubará al menos 21 días, una vez transcurridos se centrifugará el contenido del hemocultivo a 2000-2500 rpm durante 15 min y se sembrará el sedimento en medios sólidos.

También pueden utilizarse cultivos celulares mediante la técnica de shell vial. En este caso, las muestras de sangre heparinizada o tejido se diluyen en medio líquido, MEM o RMPI con suero bovino fetal, se someten a un proceso de centrifugación sobre capas de líneas celulares y se incuban durante un periodo de 15-30 días. Estos cultivos se revelan mediante una tinción de Giménez, el sobrenadante se guarda para poder inocular en posteriores cultivos celulares en el caso que se observe Bartonella spp. o para poder realizar una PCR.

7.2 CONDICIONES DE INCUBACIÖN

El crecimiento del género Bartonella (excepto B. bacilliformis) es muy lento. Las muestras deberán incubarse a 35-37ºC con un 5% de CO2 (excepto B. bacilliformis que solamente crece a 28-30ºC).

El tiempo mínimo de incubación varía dependiendo del tipo de cultivo de que se trate. Si es un cultivo primario o una muestra directa de paciente, se deberá incubar durante un periodo mínimo de 2 meses. Si por el contrario se trata de subcultivos de Bartonella spp. (previamente aislados), son necesarios solamente de 3-10 días de incubación. La larga incubación de las muestras en medios húmedos aumenta mucho el riesgo de contaminación por hongos y por bacterias de crecimiento rápido. Este problema se minimiza adicionando antimicóticos como anfotericina B al cultivo o más fácilmente mediante el cierre de la placa de cultivo con parafilm después de transcurridas las primeras 24 horas de incubación.

7.3 OBSERVACION DE LOS CULTIVOS E IDENTIFICACION DEL MICROORGANISMO

Los cultivos se examinan una vez a la semana. En cultivos primarios a partir de las 3 semanas se empieza a observar crecimiento. Las colonias tienen un aspecto gris-amarillento, son rugosas y enclavadas en el medio. Para su identificación se debe realizar tinción de Gram, oxidasa y catalasa. La identificación de género y especie se realiza mediante técnicas de PCR.

7.4 SUBCULTIVO DEL MICROORGANISMO

A partir de una colonia sospechosa de Bartonella spp. se realizará un subcultivo en agar sangre. Este se incubará en las mismas condiciones anteriormente descritas. El crecimiento de los subcultivos es más rápido, a la semana ya se pueden observar las colonias que con posteriores siembras van perdiendo rugosidad y adherencia al medio.

7.5 ALMACENAMIENTO DE LAS CEPAS AISLADAS

Las cepas aisladas se congelaran a -80ºC en un medio nutritivo tipo caldo de Brucella con un 10% de glicerol.

8. OBTENCION Y EXPRESION DE RESULTADOS

Se considera positivo el cultivo para Bartonella spp. cuando se observan en el medio pequeñas colonias entre 0,3-2,0 µm, de color blanco-amarillento y aspecto rugoso, siempre muy adheridas al medio, incrustadas en la superficie y difíciles de arrastrar con un asa de siembra y que por las técnicas de identificación se confirme que se trata de Bartonella spp.

9. RESPONSABILIDADES

Los técnicos de laboratorio serán los responsables de la realización de la técnica. El facultativo tendrá la responsabilidad de la interpretación de los resultados y la validación de los mismos.

10. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Debido a que la sensibilidad del cultivo bacteriano es baja, un resultado negativo no descarta la infección por este microorganismo. El correcto diagnóstico de infección por Bartonella spp. Debe basarse en criterios clínicos, serológicos y microbiólogicos (cultivo y PCR).

11. BIBLIOGRAFÍA

1. Agan BK, Dolan MJ. Laboratory diagnosis of Bartonella infections. Clin Lab Med 2002; 22:937-962.

2. Brenner SA, Rooney JA, Manzewitsch P et al. Isolation of Bartonella (Rochalimaea) henselae: Effects of methods of blood collecting and handling. J Clin Microbiol 1997; 35:544-547.

3. Tierno PM, Inglima K, Parisi MT. Detection of Bartonella (Rochalimeae) henselae bacteremia using Bact/Alert blood culture system. Am J Clin Pathol 1995; 104:530-536.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-05
DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR Bartonella spp. MEDIANTE SEROLOGIA

1. PROPÓSITO Y ALCANCE
El objetivo de este documento es normalizar el procesamiento de muestras para el diagnóstico serológico de la infección por Bartonella spp.
Este documento es de consulta para el personal del laboratorio encargado de su realización e interpretación.

2. FUNDAMENTO

El método serológico se basa en la detección de anticuerpos IgG e IgM específicos frente a B. henselae y B. quintana.

Este método puede utilizarse para el diagnóstico de la infección, el posible seguimiento de la enfermedad, así como para estudios de seroprevalencia. La técnica más utilizada actualmente es la inmunofluorescencia indirecta (IFI).

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA

- Normas de bioseguridad: la situación del personal y las medidas a tomar frente a los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos regulados por el Real decreto (RD) 664/97 y la adaptación contenida en la orden de 25 de marzo de 1998.

- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 10 de "Seguridad en el laboratorio de microbiología clínica", 2000.

4. MUESTRAS

4.1 PETICION

La petición que acompaña a cada muestra debe estar estrictamente cumplimentada y en ella deberá constar el número de historia, nombre, edad, servicio de procedencia, tratamiento previo, así como el diagnóstico clínico.

4.2 RECOGIDA DE LA MUESTRA

La muestra adecuada para la determinación serológica de anticuerpos es el suero y si no es posible se puede utilizar plasma. Las muestras de sangre se centrifugan a 1000-1500 g durante 10 minutos. Se conservarán a 4 ºC un máximo de 72 h. Si se demora más la realización de la técnica se congelarán a -30ºC. Las muestras hemolizadas o hiperlipémicas pueden dar problemas de interpretación.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS

Los reactivos utilizados son comercializados, por lo que el manejo y la conservación de los reactivos se ajustaran a las instrucciones del fabricante.

6. APARATOS Y MATERIAL

Estufa, congeladores, neveras, material fungible (tubos, puntas pipetas, etc) pipetas calibradas, recipientes de lavado y microscopio de fluorescencia.

7. PROCEDIMIENTO

Cada laboratorio debe describir detalladamente los pasos a seguir para realizar la técnica, desde la congelación de los sueros al atemperamiento de los reactivos. Se debe seguir en todo momento las instrucciones del fabricante.

Existen sistemas comercializados para la determinación de anticuerpos tipo IgG e IgM. Como ejemplo se recomienda realizar una determinación de cribaje a una dilución del suero de 1/64 para la IgG y 1/20 para la IgM. Si ésta es positiva se deberán realizar más diluciones dobles del suero.

8. OBTENCION Y EXPRESION DE RESULTADOS

Para la aceptación de los resultados, es imprescindible que los controles incorporados a la técnica sean correctos. En el caso en que un paciente tenga más de un suero, estos se ensayarán en paralelo para minimizar la variabilidad interensayos.

Las muestras son negativas cuando hay ausencia de fluorescencia y son positivas cuando se observan bacterias o cúmulos de bacterias fluorescentes en las células. Las muestras positivas deben diluirse y se considerará el título del suero la dilución más alta que presenta reacción positiva.

9. RESPONSABILIDADES

Los técnicos de laboratorio serán los responsables de la realización de la técnica. El facultativo tendrá la responsabilidad de la interpretación de los resultados y la validación de los mismos.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO

Las muestras obtenidas al inicio de la infección pueden ser negativas, por este motivo siempre que se sospecha una infección por Bartonella spp. es importante estudiar dos muestras recogidas en un intervalo de 15-21 días en paralelo (fase aguda y convaleciente) y observar un incremento o seroconversión de los títulos de anticuerpos (aumento de dos títulos).

Debido a que la seroprevalencia de anticuerpos frente a la Bartonella spp. en la población sana no es despreciable, se ha tenido en cuenta como valor predictivo de infección unos títulos superiores a 1/128 en casos de enfermedad por arañazo de gato, mientras que en los casos de endocarditis los títulos deben ser <1/800.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Se debe tener en cuenta que existen reacciones cruzadas entre las especies de Bartonella spp. y que mediante la serología es difícil determinar la especie causante de la infección. En algunos casos cuando se observa un título superior en dos diluciones de alguna de ellas se podría considerar a esta como responsable de la infección.

12. BIBLIOGRAFÍA

1. Agan BK, Dolan MJ. Laboratory diagnosis of Bartonella infections. Clin Lab Med 2002; 22:937-962.

2. Sander A, Posselt M, Oberle K et al. Seroprevalence of antibodies to Bartonella henselae in patients with cat scatch disease and in healthy controls: Evaluation and comparison of two commercial serological test. Clin Diag Lab Immunol 1998; 5:486-490.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-06
DIAGNÓSTICO DE LAS INFECCIONES POR Bartonella spp. MEDIANTE AMPLIFICACIÓN GENÓMICA Y SECUENCIACIÓN

1. PROPÓSITO Y ALCANCE
El objetivo de este documento es describir el procesamiento de muestras para el diagnóstico mediante técnicas de PCR de la infección por Bartonella spp.

2. FUNDAMENTO
Las técnicas moleculares se basan en la detección de ADN específico de Bartonella spp. Este método puede utilizarse para el diagnóstico de la infección en muestras biológicas (biopias o sangre) y para la identificación de las cepas aisladas.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
- Gestión de residuos
- Normas de bioseguridad: la situación del personal y las medidas a tomar frente a los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos regulados por el Real decreto (RD) 664/97 y la adaptación contenida en la orden de 25 de marzo de 1998.
- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 10 de Seguridad en el laboratorio de microbiología clínica, 2000.

4. MUESTRAS

4.1 PETICION

La petición que acompaña a cada muestra debe estar estrictamente cumplimentada y en ella deberá consta el número de historia, nombre, edad, servicio de procedencia, tratamiento previo, así como el diagnóstico clínico.

4.2 RECOGIDA DE LA MUESTRA

Las determinaciones se pueden realizar en biopsias (piel, válvulas, ganglios), o en sangre (con EDTA), las muestras se mantendrán congelas a – 80ºC hasta la realización de la técnica.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS

Los reactivos para la extracción de ADN, la realización de la PCR y purificación del producto para una posterior secuenciación se encuentran actualmente comercializados, por lo que el manejo y la conservación de los reactivos se ajustaran a las instrucciones del fabricante. Los iniciadores para la detección de Bartonella spp. son variados dependiendo de las publicaciones consultadas. No existe en el mercado español un reactivo comercializado de amplificación para este microorganismo. Los productos utilizados para la realización del gel de agarosa (agarosa en polvo, bromuro de etidio, TBE) se conservan a temperatura ambiente y los controles de peso molecular en el congelador de –80ºC.

6. APARATOS Y MATERIALES

Congeladores, neveras, microondas, balanzas, material fungible para realizar la PCR, pipetas calibradas, termociclador, secuenciador, fuente de corriente, bateas para correr los geles de azarosa.

7. PROCEDIMIENTO

Cada laboratorio debe describir detalladamente los pasos a seguir para realizar cada fase de este procedimiento, desde la congelación de las muestras, el atemperamiento de los reactivos, el proceso de extracción del ADN, el proceso de amplificación de ADN, la preparación de geles de agarosa y la secuenciación. En todos estos aspectos se deben seguir las recomendaciones de los fabricantes, ya que en la mayoría de los casos se trata de sistemas comercializados (ver apartado 2.3.4. del documento científico de este procedimiento).

La técnica de PCR es útil para el diagnóstico de la infección aplicada a muestras clínicas y para la identificación de cepas. La metodología a seguir en ambos es la misma excepto en el proceso de extracción de ADN que dependerá del tipo de muestra.

Para la determinación del género Bartonella una de las secuencias más útiles es BhCS.781p y BhCS.1137n, que corresponden a un fragmento del gen de la citrato sintasa (gltA) de Bartonella spp. Para la diferenciación de las especies existe aún más variedad de secuencias, da buen resultado utilizar los iniciadores complementarios de la región intergénica del 16S-23S ARNr. Una vez realizada la PCR si es positiva para el género Bartonella, se puede deducir la especie mediante su visualización en el gel de agarosa y confirmar el resultado mediante la secuenciación.

8. OBTENCION Y EXPRESION DE RESULTADOS

Para la aceptación de los resultados, es imprescindible que los controles incorporados a la técnica sean correctos. Siempre se utilizará un control negativo (para evidenciar contaminación de cualquier reactivo) y un control positivo para comprobar que la reacción de amplificación ha tenido lugar. Las muestras son negativas cuando no existe amplificación de ADN para el microorganismo que se pretende detectar y por tanto no se observa ninguna banda en el gel de azarosa, y son positivas cuando este ADN se amplifica y se puede observar una banda a la altura del gel esperada. Siempre se debe utilizar un marcador de pesos moleculares para comprobar el tamaño de la banda.

9. RESPONSABILIDADES

Los técnicos de laboratorio serán los responsables de la realización de la técnica. El facultativo tendrá la responsabilidad de la interpretación de los resultados y la validación de los mismos.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO

La principal limitación de esta técnica es la dificultad de disponer de muestras adecuadas, como válvulas cardiacas para el diagnostico de endocarditis o biopsias. También al tratarse de técnicas manuales que se han de optimizar resulta difícil su incorporación al laboratorio de rutina, con lo cual se suelen realizar en centros especializados.

Los resultados de las técnicas moleculares son buenos cuando se aplican a la identificación de cepas y muestras de biopsias, pero no así en muestras de sangre que presentan mayores problemas en su interpretación.

11. BIBLIOGRAFÍA

1. Agan BK, Dolan MJ. Laboratory diagnosis of Bartonella infections. Clin Lab Med 2002; 22:937-962.

2. Avidor B, Kletter Y, Abulafia S, et al. Molecular diagnosis of cat scratch disease: a two-step approach. J Clin Microbiol 1997; 35:1924-1930.

3. Jensen WA, Fall MZ, Rooney J, et al. Rapid identification and differentiation of Bartonella species using a single-step PCR assay. J Clin Microbiol 2000; 38:1717-1722.

4. Regnery RL, Anderson BE, Clarridge JE, et al. Characterization of a novel Rochalimaea species, B. henselae spp. nov., isolated from blood of a febrile human immunodeficient virus-positive patient. J Clin Microbiol 1992; 30:265-274.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-07
AISLAMIENTO DE Rickettsia spp. A PARTIR DE MUESTRAS CLÍNICAS MEDIANTE CULTIVO

1. PROPÓSITO Y ALCANCE
El objeto de este procedimiento es describir la metodología de aislamiento de rickettsias a partir de muestras clínicas. Este procedimiento se lleva a cabo mediante cultivos celulares inoculados con muestras de pacientes en los que se sospecha una rickettsiosis. Es aplicable a determinadas muestras clínicas que se reciben en los laboratorios clínicos siendo obligatorio disponer de un laboratorio de bioseguridad de nivel 3.

2. FUNDAMENTO
El cultivo es la técnica diagnóstica más específica, además de ser fundamental para la obtención de antígenos y para estudiar la sensibilidad a los antibióticos. Sin embargo, el aislamiento de rickettsias mediante cultivo celular convencional a partir de una muestra procedente de un paciente con rickettsiosis es un proceso muy laborioso, poco sensible y tiene el inconveniente de retrasar la emisión de los resultados. Cuando crece una rickettsia el efecto citopático no siempre tiene lugar y, cuando se produce, no es específico de especie. Además, aunque puede aparecer a las 24-48 h post- inoculación, generalmente se necesitan varios días para su desarrollo. El cultivo se puede acelerar si se inocula la muestra sobre una monocapa de células susceptibles previamente crecidas sobre un portaobjetos circular (shell vial), seguida de una centrifugación. Después de 5-7 días de incubación se puede detectar la presencia de la bacteria mediante la tinción de Giménez, inmunofluorescencia indirecta (IFI) con anticuerpos específicos o bien mediante técnicas moleculares como la PCR (reacción en cadena de la polimerasa).
Para la identificación de la especie de rickettsia aislada, se precisa la secuenciación de una diana específica de especie.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
- Laboratory Biosafety Manual (WHO, 2003).
- Manual de instrucciones de funcionamiento y mantenimiento de equipos del laboratorio (centrífuga, termociclador, estufa, etc.).
- Preparación de medios, reactivos y viales con cultivos celulares.
- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 1a de "Recogida, transporte y procesamiento general de las muestras en el laboratorio de microbiología", 2003.
- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 10 de "Seguridad en el laboratorio de microbiología clínica", 2000.
- Procedimiento del laboratorio sobre gestión de residuos.
- Protocolo del laboratorio de verificación y calibración de equipos e instrumentos.

4. MUESTRAS

4.1. TIPO DE MUESTRA, RECOGIDA, TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN

La muestra más adecuada para el cultivo de rickettsias es la sangre recogida con citrato o heparina. Se recogerá según se indica en el Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 1a de "Recogida, transporte y procesamiento general de las muestras en el laboratorio de microbiología" (PNT-RTP-01. 2003). Las muestras se deben recoger en contenedores estériles de un solo uso con cierre hermético y enviarse, a ser posible, el mismo día de la extracción y sin congelar. Si el envío no se va a realizar de manera inmediata, conviene congelar a ?80ºC hasta su envío, que debe llevarse a cabo en hielo seco para prevenir la descongelación.

4.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

En términos generales, el procedimiento utilizado para el procesamiento de estas muestras es el habitual del laboratorio de microbiología. Hay que tener en cuenta que la bacteriemia durante una rickettsiosis es de menor intensidad que en el caso de otras infecciones, lo que obliga a recoger mayor cantidad de muestra para obtener un rendimiento óptimo.

Las muestras deben manejarse como potencialmente peligrosas. Cuando una muestra se recibe en el laboratorio, y antes de procesarse, debe someterse a una inspección previa para asegurarse que ha sido bien seleccionada, recogida y transportada. Las muestras se rechazarán en los siguientes casos: 1) muestra no identificada, 2) transporte inadecuado o demasiado prolongado, 3) muestra derramada, 4) cantidad insuficiente. Las muestras inaceptables no deben procesarse y el médico debe ser informado inmediatamente. En estos casos, se contactará con el médico solicitante para pedir una nueva muestra.
Los consejos generales para optimizar el procesamiento de muestras son:

1. Comprobar que el etiquetado de la muestra es correcto.
2. Registrar toda la información necesaria que pudiera afectar a la calidad de la muestra que represente algún interés diagnóstico así como aspectos relacionados con su recogida, transporte y conservación.
3. Durante el procesamiento, deben seguirse todas las medidas de seguridad necesarias, tanto para el personal como para la muestra.
4. El procesamiento debe llevarse a cabo tan pronto como sea posible garantizando de esta forma la viabilidad del patógeno.

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y PRODUCTOS

5.1. CULTIVOS CELULARES

Viales de plástico de fondo plano de 15 mm de diámetro externo (5 ml de capacidad) con tapón, conteniendo una monocapa confluente de células Vero formada sobre un cubreobjetos redondo de 12 mm de diámetro. Estos viales se preparan normalmente en el propio laboratorio (al menos 24 horas antes), a razón de 50.000 células/ml, aproximadamente. También serán aceptables los cultivos shell vial de procedencia comercial y calidad controlada por el fabricante y el laboratorio.

5.2. REACTIVOS

- Células Vero (ATCC CCL-81).
- Medio MEM (Minimum Essential Medium), (varios proveedores).
- Suero bovino fetal (varios proveedores).
- L-glutamina (varios proveedores).
- Aminoácidos no esenciales (varios proveedores).
- Medio de cultivo: Medio MEM suplementado con suero bovino fetal (SBF) al 10% (concentración final, CF), 2 mM de L-glutamina (CF) y 0,2% CF de aminoácidos no esenciales.
- Tripsina (varios proveedores).
- Tripsina-verseno: Tripsina al 0,25 % CF en PBS con 1 mM CF de EDTA (ácido etilen-diamino- tetraacético).
- Tampón fosfato salino (PBS) de pH 7,2, estéril. Puede ser de procedencia comercial, (varios proveedores).
- Azul tripán (varios proveedores).

6. APARATOS Y MATERIAL NECESARIOS

6.1. INSTRUMENTAL

- Cabina de flujo laminar vertical de nivel de bioseguridad clase II.
- Centrífuga con adaptadores para viales que alcance una velocidad de 4.000 x g.
- Estufa convencional.
- Microscopio invertido, dotado de objetivos de 10, 20 y 40x.
- Cámara hematocimétrica.

6.2. MATERIALES

- Pipetas Pasteur estériles.
- Micropipetas de varios volúmenes.
- Puntas de micropipeta.
- Pipetas de 5 y 10 ml estériles.
- Pipetus.
- Viales estériles para shell vial.
- Cubreobjetos circulares de vidrio de 12 mm, estériles.
- Frascos de cultivo Falcon de 25 cm2 (varios proveedores).

7. PROCEDIMIENTO

7.1. CULTIVOS CELULARES: PREPARACIÓN DE VIALES shell vial

- Lavar las células eliminando el medio de cultivo y añadiendo 5 ml de solución de PBS estéril en el frasco Falcon que contiene la monocapa de células Vero.

- Tripsinizar las células añadiendo 2-3 ml de solución de tripsina-verseno, incubar a 37ºC unos segundos.

- Cuando las células empiecen a despegarse, parar la tripsinización añadiendo 5-10 ml de medio de cultivo.

- Mediante una pipeta aspirar y expulsar el medio, haciendo que el líquido golpee la superficie del cultivo, con el fin de despegar las células y lograr una suspensión homogénea. Evitar, en la medida de lo posible, la formación de espuma.

- Contar las células viables en cámara hematocimétrica con azul tripán (son viables las que no permiten la entrada del colorante).

- Ajustar la suspensión a 50.000 células/ml, añadiendo medio de cultivo.

- Repartir en los viales shell vial, a razón de 1 ml por tubo.

- Colocar los tubos en la estufa a 37ºC e incubar hasta que se forme una monocapa confluente.

- Al día siguiente, visualizar los tubos al microscopio invertido para ver si la monocapa está bien formada y no hay contaminación.

7.2. INOCULACIÓN DE LOS VIALES

- Rotular los viales con el número de laboratorio y la fecha de inoculación.

- Antes de inocular, eliminar el medio MEM de los viales.

- Se inoculan 0,2 ml de la muestra por cada vial.

- Idealmente el número de viales a sembrar será de 2 por muestra. En algunos casos, según las características clínicas y a juicio del facultativo responsable del laboratorio, se podría incrementar el número de viales.

- Centrifugar a 2.500 ´ g durante 30 minutos a 22ºC.

- Aspirar la muestra, con cuidado de no levantar la monocapa.

- Añadir 1,5 ml de medio de cultivo e incubar a 33-35ºC en estufa.

- Al día siguiente, visualizar los tubos al microscopio invertido para ver si la monocapa está en buenas condiciones y no existe contaminación; cambiar nuevamente el medio de crecimiento.

- Incubar a 33-35 ºC en estufa, durante 4-6 días.

7.3. SUBCULTIVO O PASE DE LOS CULTIVOS

- Raspar la monocapa utilizando una punta de micropipeta o bien bolitas de vidrio estériles.

- Pasar 1ml del cultivo a un frasco Falcon de 25 cm², en el que previamente se ha crecido una monocapa confluente de células Vero y se ha retirado el medio de cultivo.

- Rotular el nuevo frasco poniendo el número de muestra, el número de pase y la fecha de subcultivo.

- Incubar 30 min. a temperatura ambiente, moviendo el frasco suavemente cada 5 min. - Retirar el sobrenadante.

- Añadir 5 ml de medio de cultivo.

- Incubar a 33-35ºC en estufa.

- Al día siguiente, observar los frascos al microscopio invertido, para ver si la monocapa está en buenas condiciones y no hay contaminación.

- Incubar a 33-35 ºC en estufa.

7.4. PROCESAMIENTO DE LOS CULTIVOS.

Una vez incubado el cultivo durante 5-7 días, se raspa la monocapa y se procede a determinar si está creciendo una rickettsia mediante la tinción de Giménez, IFI con suero específico o técnicas moleculares, como la PCR. Para la identificación de la especie de rickettsia, se precisa la secuenciación de una diana específica de ADN. Aún obteniendo un resultado negativo, no se puede descartar la presencia de una rickettsia en el cultivo hasta pasados 20 días de incubación.

7.5. PUNTOS CRÍTICOS EN LA REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA

No existen puntos especialmente críticos fuera de la realización metódica de toda técnica de laboratorio. Sin embargo, hay que tener en cuenta que los cultivos celulares se realizan en ausencia de antibióticos, por lo que hay que ser muy cuidadosos para prevenir contaminaciones. También, se deben manipular con precaución los cubreobjetos, para que no se rompan o se dañe la monocapa.

7.6. CONTROL DE CALIDAD

- El habitual de control de los reactivos.

- Cada nuevo lote de suero debe analizarse para asegurar el crecimiento adecuado de las células Vero. El resultado se señalará en el registro de control de calidad de reactivos correspondiente.

8. OBTENCION Y EXPRESION DE RESULTADOS

Un efecto citopático no indica necesariamente la presencia de una rickettsia en el cultivo. En este caso, si la realización de pruebas complementarias indica la ausencia de la bacteria, el resultado se debe expresar como "Muestra tóxica: resultado no valorable". Si con la tinción de Giménez se observara una imagen microscópica típica de crecimiento bacteriano, hay que tener en cuenta que no hay diferenciación a nivel de especie y que también pueden crecer otros microorganismos intracelulares, por lo que se deben realizar otros análisis para el diagnóstico etiológico de la infección. Los resultados de PCR e IFI en el cultivo se expresan en términos cualitativos de positivo o negativo.

9. RESPONSABILIDADES

Básicamente son las siguientes:

- Personal del área de recogida y procesamiento de muestras: recepción, identificación y procesamiento de las muestras, rechazo de las muestras remitida en condiciones defectuosas y adopción de medidas correctoras.

- Personal técnico: control de las muestras, solicitudes y hojas de trabajo, realización de la técnica, lectura y registro de resultados, archivo de hojas de trabajo.

- Facultativo responsable: supervisión del trabajo y de los resultados, resolución de dudas técnicas, adopción de medidas correctoras en el caso de que se hayan cometido errores, firma del informe de resultados.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO

La positividad del cultivo en shell vial indica la presencia de una determinada especie de rickettsia en la muestra y, por tanto, demuestra que el paciente sufre una infección activa. Para asociar la infección al cuadro clínico del paciente deben valorarse conjuntamente todos los datos clínicos y epidemiológicos.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

El cultivo de rickettsias resulta muy laborioso y se requiere personal especializado e instalaciones con nivel de seguridad 3, por lo que su realización queda limitada a los laboratorios que cumplan de este tipo de requisitos. Además, debido a su baja sensibilidad, no se recomienda realizar este procedimiento en el caso de muestras procedentes de pacientes que hayan comenzado un tratamiento antibiótico. Todo ello hace que este procedimiento resulte poco viable en la rutina hospitalaria, por lo que debe realizarse sólo en casos seleccionados. Por otra parte, la implicación de un número creciente de especies de rickettsia en patología humana hace que no se disponga, en ocasiones, de la experiencia adecuada para la identificación de determinadas especies potencialmente patógenas. En estos casos, las muestras deberán ser remitidas a un centro de referencia.

Una limitación de la técnica es el aumento de la toxicidad de la muestra sobre la monocapa celular durante el proceso. Esto ocurre especialmente en muestras como la sangre (fracción leucocitaria) y muestras de tejidos, precisamente aquellas en las que mayor significado clínico tiene el cultivo de la bacteria.

12. BIBLIOGRAFÍA

1. Gouriet F, Fenollar F, Patrice JY et al. Use of shell-vial cell culture assay for isolation of bacteria from clinical specimens: 13 years of experience. J Clin Microbiol 2005; 10:4993-5002.

2. Parola P, Paddock CD, Raoult D. Tick-borne rickettsioses around the world: emerging diseases challenging old concepts. Clin Microbiol Rev 2005; 18:719-56.

3. Quesada M, Sanfeliu I, Cardenosa N et al. Ten years' experience of isolation of Rickettsia spp. from blood samples using the shell-vial cell culture assay. Ann N Y Acad Sci 2006; 1078:578-581.

4. Vestris G, Rolain JM, Fournier PE et al. Seven years' experience of isolation of Rickettsia spp. from clinical specimens using the shell vial cell culture assay. Ann N Y Acad Sci 2003; 990:371-374.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-08
DIAGNÓSTICO DE LAS RICKETTSIOSIS MEDIANTE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA

1. PROPÓSITO Y ALCANCE
El objetivo de este documento es describir el diagnóstico serológico de las rickettsiosis mediante la utilización de la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI). Este procedimiento es aplicable a los laboratorios clínicos que reciben muestras de sueros procedentes de pacientes con sospecha de infección por Rickettsia spp.

2. FUNDAMENTO
Los métodos serológicos se basan en la detección de anticuerpos específicos frente a Rickettsia spp., generalmente de tipo IgG e IgM. Al igual que otras serologías, este método se puede utilizar para el diagnóstico de la infección, para el seguimiento de la respuesta inmune específica y para conocer la prevalencia de anticuerpos frente a este microorganismo. Para la realización de esta técnica los antígenos utilizados, que consisten en células infectadas por diferentes especies de Rickettsia, están comercializados, estandarizados y prefijados en los portaobjetos, sobre los que se añaden diferentes diluciones del suero del paciente. En el caso de que existan anticuerpos frente al correspondiente antígeno, se formará un complejo antígeno-anticuerpo que será revelado mediante una anti-inmunoglobulina humana de origen animal, marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y visualizado con un microscopio de fluorescencia.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
- Laboratory Biosafety Manual (WHO, 2003).
- Manual de instrucciones de funcionamiento y mantenimiento de equipos del laboratorio (centrífuga, termociclador, estufa, etc.).
- Preparación de medios, reactivos y viales con cultivos celulares.
- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 1a de "Recogida, transporte y procesamiento general de las muestras en el laboratorio de microbiología", 2003.
- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 10 de "Seguridad en el laboratorio de microbiología clínica", 2000.
- Procedimiento del laboratorio sobre gestión de residuos.
- Protocolo del laboratorio de verificación y calibración de equipos e instrumentos.

4. MUESTRAS

4.1. TIPO DE MUESTRA, RECOGIDA, TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN

La muestra a analizar mediante IFI de rickettsias es el suero. Éste se recoge según se indica en el Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 1a de "Recogida, transporte y procesamiento general de las muestras en el laboratorio de microbiología". PNT-RTP-01 (2003), y se envía en contenedores estériles de un solo uso y con cierre hermético. El suero debe enviarse refrigerado lo antes posible. Si el envío no se va a realizar de manera inmediata, conviene congelarlo a ?20ºC hasta su envío, el cual deberá llevarse a cabo en hielo seco para prevenir su descongelación.

4.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

En términos generales, el procedimiento utilizado para el procesamiento de estas muestras es el habitual del laboratorio de microbiología. Cuando una muestra se recibe en el laboratorio, y antes de procesarse, debe someterse a una inspección previa para asegurarse que ha sido bien seleccionada, recogida y transportada. Las muestras se rechazarán en los siguientes casos: 1) muestra no identificada, 2) transporte inadecuado o demasiado prolongado, 3) muestra derramada, 4) cantidad insuficiente. Además de estos casos, no se aceptará suero hemolítico ni hiperlipémico. Las muestras inaceptables no deberán procesarse y el médico deberá ser informado inmediatamente. En estos casos, se contactará con el médico solicitante para pedir una nueva muestra.

Los consejos generales para optimizar el procesamiento de las muestras son:

1. Comprobar que el etiquetado de la muestra es correcto.
2. Registrar toda la información necesaria que pudiera afectar a la calidad de la muestra y que represente interés diagnóstico así como aspectos relacionados con su recogida, transporte y conservación.
3. Durante el procesamiento, deben seguirse todas las medidas de seguridad necesarias, tanto para el personal que lleva a cabo la manipulación como para la muestra.

Puesto que resulta importante realizar estudios cuantitativos de sueros del mismo paciente a lo largo del tiempo, es fundamental conservar una alícuota congelada a -20ºC de cada muestra que se analice para poder realizar en paralelo el estudio comparativo con las diferentes muestras.

5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y PRODUCTOS

- Tampón fosfato salino (PBS) pH 7,2 (varios proveedores).

- Tween 80 (varios proveedores).

- PBS-Tween 80: diluir 65±5 µL de Tween 80 en 1 L de PBS.

- Portaobjetos comerciales con el antígeno fijado (BioMérieux, Francia; Focus Diagnostics, USA; y Vircell, España).

- Anti-inmunoglobulina humana conjugada con FITC de procedencia comercial (varios proveedores).

- Cubreobjetos (60 x 24 mm) (varios proveedores).

- Líquido de montaje (varios proveedores).

- Azul de Evans (varios proveedores).

6. APARATOS, MATERIAL E INSTRUCCIONES DE SEGURIDAD

6.1. INSTRUMENTAL

- Estufa.

- Microscopio de fluorescencia.

6.2. MATERIALES

- Tubos de plástico de fondo cónico tipo Eppendorf de 1,5 ml.

- Gradillas.

- Micropipetas de varios volúmenes.

- Puntas para micropipetas.

- Pipetas de 5 y 10 ml estériles.

- Pipetus.

- Vortex.

- Matraz aforado de 500 ml ó 1.000 ml para la preparación de soluciones.

- Frasco lavador para el tampón.

- Cubreobjetos de 60x24 mm.

- Cámara húmeda.

- Cubetas de lavado de los portaobjetos.

- Sujeta-portaobjetos.

7. PROCEDIMIENTO

7.1. PROTOCOLO DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)

1) Antes de comenzar con la realización de la técnica, atemperar los portaobjetos, controles y conjugados durante 5 min. 2) Utilizando placas de microtitulación, realizar diluciones seriadas de los sueros (1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280, 1/2560 y 1/5120) con tampón PBS.

3) Sacar los portas con el antígeno teniendo cuidado de no tocar las áreas con antígeno. Para el marcado de los portas usar sólo lápiz de punta dura, nunca rotulador.

4) Aplicar 10 µl de cada dilución en cada pocillo por duplicado. Incluir un suero control positivo y un control negativo. El positivo consistirá en un suero de título alto, procedente de un paciente que ha sufrido una rickettisosis. El negativo será un suero procedente de una persona que no ha sufrido esta infección.

5) Incubar en cámara húmeda a 37ºC durante 30 min.

6) Extraer el portaobjetos de la cámara húmeda y lavar 2 veces durante 5 min. en una cubeta con PBS-Tween 80. No mover el portaobjetos dentro del PBS-Tween 80. Sacar los portas y enjuagarlos en otra cubeta con agua destilada. Dejar secar los portas completamente.

7) Añadir 10 µL del conjugado a la dilución recomendada a cada pocillo, cubriéndolos completamente con el mismo. La dilución del conjugado se prepara con una solución de azul de Evans al 1/100 en PBS. Se utilizan los conjugados anti-IgG, anti-IgM y anti-inmunoglobulinas totales.

8) Incubar en cámara húmeda a 37ºC durante 30 min.

9) Repetir el punto nº 6 y dejar secar.

10) Aplicar líquido de montaje y cubrir con el cubreobjetos sin que se formen burbujas. Eliminar el líquido de montaje sobrante.

7.2. LECTURA E INTERPRETACIÓN

Realizar una observación inmediata en el microscopio de fluorescencia con el objetivo de 20x. Si esto no fuera posible, guardar los portas en un lugar oscuro y frío para protegerlos de la desecación realizando la lectura dentro de las siguientes 24 h.

- En caso de resultado positivo se observa una fluorescencia puntiforme característica que evidencia la presencia de las rickettsias y contrasta con el rojo del citoplasma celular producido por el azul de Evans.

- Los sueros negativos dan lugar a una coloración roja uniforme.

Durante la observación, se recomienda no concentrarse mucho tiempo en la misma área, siendo preferible desplazarse por toda la preparación con el fin de evitar pérdidas de fluorescencia. Para ello debe hacerse un barrido con objetivo 20x.

7.3. PUNTOS CRÍTICOS EN LA REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA

No existen puntos especialmente críticos fuera de la realización metódica de toda técnica de laboratorio.

7.4. CONTROL DE CALIDAD

- El habitual de control de los reactivos.

- Cada nuevo lote de suero control positivo debe titularse. El resultado se señalará en el registro de control de calidad de reactivos correspondiente.

8. OBTENCION Y EXPRESION DE RESULTADOS

8.1. OBTENCIÓN DE LOS RESULTADOS

Para la aceptación de los resultados, es imprescindible la validación del ensayo en función del resultado de los controles y los criterios establecidos por el fabricante. El control positivo debe presentar una fluorescencia intensa y brillante de color verde manzana y debe proporcionar el título esperado dentro del rango de una dilución mayor o menor. Si el título no es el esperado, se debe repetir todo el procedimiento. El control negativo debe presentar ausencia de fluorescencia. Una fluorescencia amarillenta o verde oscura corresponde a una reactividad inespecífica y no debe tenerse en cuenta.
Evaluación positiva: la fluorescencia específica es de un color verde manzana con una intensidad generalmente de 1+ (débil), 2+ (moderado), 3+ (brillante), hasta 4+ (muy brillante).
Evaluación negativa: ausencia de fluorescencia.
Como en todas las serologías, se considera que ha tenido lugar una seroconversión cuando al analizar dos muestras de suero obtenidas de un paciente con una diferencia de unos 20 días, se observa un aumento del nivel de anticuerpos de como mínimo cuatro veces el título inicial.

8.2 EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Los resultados obtenidos son cualitativos (positivo o negativo) y cuantitativos (título del suero).
- A partir de un título único mayor o igual a 1/40 el suero se considera positivo.
- Seroconversión: se observa un aumento del título de, al menos, cuatro veces entre los dos sueros pareados.

9. RESPONSABILIDADES

Básicamente serán las siguientes: - Área de recogida y procesamiento de muestras: recepción, identificación y procesamiento de las muestras. Rechazo de las muestras remitidas en condiciones defectuosas y adopción de medidas correctoras.

- Personal técnico: control de las muestras, solicitudes y hojas de trabajo, realización de la técnica, lectura de las preparaciones, registro de resultados y archivo de hojas de trabajo.

- Facultativo responsable: supervisión del trabajo y de los resultados, resolución de dudas técnicas, interconsultas, adopción de medidas correctoras de errores cometidos y firma de informes de resultados.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO

Para minimizar la variabilidad entre diferentes ensayos, a la hora de estudiar la variación en el título de anticuerpos en un paciente a lo largo del tiempo, deben analizarse simultáneamente todos los sueros del paciente. Así, se evitan posibles variaciones de una o dos diluciones, disminuye el error debido al azar y se aumenta la exactitud de la técnica. Cada suero se debe analizar utilizando los conjugados anti-IgM, anti-IgG o anti-inmunoglobulinas totales. En el caso de la determinación de las IgMs, previamente la muestra deberá tratarse con un reactivo comercial para la absorción de las IgGs, a efectos de eliminar falsos positivos debidos al factor reumatoide.

Hay que tener en cuenta que sólo existen portaobjetos comerciales para R. conorii, R. rickettsii y R. typhi. Para el estudio serológico con otras especies, se deben producir los antígenos y preparar los portas en el propio laboratorio. Esto presenta el inconveniente de que el cultivo de rickettsias resulta muy laborioso, se requiere personal especializado e instalaciones con nivel de seguridad 3, por lo que su realización queda limitada a los laboratorios que cumplan estos requisitos.

Para una correcta interpretación de los resultados de serología, deben tenerse en cuenta los datos de reactividad basal de la población en zonas endémicas.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

La IFI para la detección de anticuerpos frente a Rickettsia está considerada la mejor prueba diagnóstica serológica. Sin embargo, se encuentra limitada por las reacciones cruzadas entre diferentes especies de rickettsia. Otra limitación común a otros ensayos serológicos, es la necesidad del estudio de sueros pareados para poder demostrar una seroconversión, ya que en ocasiones no se llega a disponer de una segunda muestra de suero. Un inconveniente adicional es que la seroconversión puede tardar varias semanas en producirse desde el inicio de los síntomas, retrasando en el diagnóstico. Además, en algunos casos no se produce seroconversión, lo que no excluye la enfermedad.

12. BIBLIOGRAFÍA

1. Brouqui P, Bacellar F, Baranton G et al. Guidelines for the diagnosis of tick-borne bacterial diseases in Europe. Clin Microbiol Infect 2004; 10:1108-1132.

2. Parola P, Raoult D. Ticks and tickborne bacterial diseases in humans: an emerging infectious threat. Clin Infect Dis 2001; 32:897-928. (Erratum, Clin Infect Dis 33:749.).

3. Parola P, Paddock CD, Raoult D. Tick-borne rickettsioses around the world: emerging diseases challenging old concepts. Clin Microbiol Rev 2005; 18:719-756.

4. Rolain JM, Shpynov S, Raoult D. Spotted-fever-group rickettsioses in north Asia. Lancet 2003; 362:1939.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-09
DETECCIÓN DIRECTA DE Rickettsia spp. EN MUESTRAS CLÍNICAS MEDIANTE AMPLIFICACIÓN GENÓMICA Y SECUENCIACIÓN DEL GEN gltA

1. PROPÓSITO Y ALCANCE
El objeto de este procedimiento es describir la metodología de detección de las especies de Rickettsia en muestras clínicas mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa) convencional y posterior secuenciación del producto amplificado. Este procedimiento es aplicable a todas las muestras clínicas con sospecha de rickettsiosis que se reciben en los laboratorios de microbiología clínica que realicen diagnóstico molecular. También es aplicable al ADN extraído a partir de cultivos infectados con muestras clínicas (ver el PNT-EMG-07: Aislamiento de Rickettsia spp. a partir de muestras clínicas mediante cultivo).

2. FUNDAMENTO
Las técnicas moleculares son un instrumento valioso para el diagnóstico etiológico de las rickettsiosis, ya que pueden detectar en poco tiempo el genoma de cualquier patógeno potencial, independientemente de la viabilidad del microorganismo. Estas técnicas se ven menos afectadas que los cultivos por los tratamientos antibióticos previos, aunque también pueden disminuir la sensibilidad, y la obtención de los resultados es mucho más rápida en comparación con el cultivo. Además tienen alta sensibilidad y especificidad. Por el momento, la mayor parte de las técnicas descritas son de desarrollo propio (in house), no estando comercializadas. Aunque existe una gran cantidad de dianas descritas, el gen gltA es una de las más comúnmente utilizadas puesto que está presente en todas las especies de Rickettsia.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
- Laboratory Biosafety Manual (WHO, 2003).
- Manual de instrucciones de funcionamiento y mantenimiento de equipos del laboratorio (centrífuga, termociclador, estufa, etc.).
- Preparación de medios, reactivos y viales con cultivos celulares.
- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 1a de "Recogida, transporte y procesamiento general de las muestras en el laboratorio de microbiología", 2003.
- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 10 de "Seguridad en el laboratorio de microbiología clínica", 2000.
- Procedimiento del laboratorio sobre gestión de residuos.
- Protocolo del laboratorio de verificación y calibración de equipos e instrumentos.

4. MUESTRAS

4.1. TIPO DE MUESTRA, RECOGIDA, TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN

Las muestras más adecuadas para el diagnóstico molecular de rickettsias son sangre extraída con citrato o EDTA, muestra cutánea de la escara de inoculación, contenido de pápulas o máculas y en el caso de afectación neurológica, LCR. Se recogerá según se indica en el Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 1a de "Recogida, transporte y procesamiento general de las muestras en el laboratorio de microbiología". PNT-RTP-01. 2003. Las muestras se deben recoger y enviar en contenedores estériles de un solo uso y con cierre hermético.

4.2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS:

En términos generales, el procedimiento utilizado para el procesamiento de estas muestras es el habitual del laboratorio de microbiología, si bien hay que tener en cuenta que la bacteriemia durante una rickettsiosis es menor que en el caso de otras infecciones. Esto obliga a recoger mayor cantidad de muestra para obtener un rendimiento óptimo.

Las muestras deben manejarse como si tuvieran microorganismos potencialmente peligrosos. Cuando una muestra se recibe en el laboratorio, y antes de procesarse, debe someterse a una inspección previa para asegurarse que ha sido bien seleccionada, recogida y transportada. Las muestras se rechazarán en los siguientes casos: 1) muestra no identificada, 2) transporte inadecuado o demasiado prolongado, 3) muestra derramada, 4) cantidad insuficiente. Las muestras inaceptables no deben procesarse y el médico debe ser informado inmediatamente. En estos casos, se contactará con el médico solicitante para pedir una nueva muestra.

Los consejos generales para optimizar el procesamiento de muestras son:

1. Comprobar que el etiquetado de la muestra es correcto.

2. Registrar toda la información necesaria que pudiera afectar a la calidad de la muestra y que represente interés diagnóstico así como aspectos relacionados con su recogida, transporte y conservación.

3. Durante el procesamiento, deben seguirse todas las medidas de seguridad necesarias, tanto para el personal como para la muestra.

4. El procesamiento debe llevarse a cabo tan pronto como sea posible garantizando de esta forma la estabilidad del ADN del patógeno.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS

5.1. REACTIVOS PARA LA EXTRACCIÓN DE ADN

Se utilizará el kit "QIAamp DNA Blood" (QIAGEN, Hilden, Germany), para la extracción de ADN a partir de muestras de sangre, suero y LCR. Para biopsias cutáneas se utilizará el kit "QIAamp DNA Tissue" (QIAGEN).

5.2. REACTIVOS PARA LA AMPLIFICACIÓN

(volumen de reacción: 100 µL).

- 1x de tampón de PCR.

- 0, 2 mM de MgCl₂.

- Dinucleotidos trifosfato (dNTPs) a 200 µM cada uno de ellos (varios proveedores).

- Oligonucleótidos 10 pmol µmol de cada uno de ellos:

Rp877p: 5'-GGGGACCTGCTCACGGCGG-3'

Rp1258n: 5'-ATTGCAAAAAGTACAGTGAACA-3'

- 1,25 U Taq polimerasa (varios proveedores).

5.3. REACTIVOS PARA LA ELECTROFORESIS

- Tampón TBE 1´ (Tris-HCl 100 mM, ácido bórico 90 mM, Na₂EDTA.2H₂O 1 mM; pH 8,3).

- Tampón de carga para electroforesis (azul de bromofenol 0,25%, cianol xileno FF 0,25%, glicerol 30%). - Marcador de tamaño molecular de intervalo 100-1.000 pb (varios proveedores).

- Agarosa "Low Melting" (varios proveedores).

- Bromuro de etidio (10 mg/ml).

- Agua destilada.

5.4. REACTIVOS PARA LA PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO AMPLIFICADO

Se utilizará el kit "QUIAquick gel extraction" (QIAGEN).

5.5. REACTIVOS PARA LA SECUENCIACIÓN

Se utilizará el kit "BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing v2.0 Ready Reaction" Applied Biosystems (USA).

6. APARATOS Y MATERIAL NECESARIOS

6.1. INSTRUMENTAL

- Cabina de Seguridad Biológica de clase IIA.

- Microcentrífuga para tubos de fondo tipo Eppendorf y rotor angular, con velocidad de rotación de 16.000 x g.

- Agitador orbital tipo vortex.

- Bloques de calor seco o termobloques.

- Termociclador.

- Balanza de precisión.

- Espectrofotómetro.

- Microondas para fundir la agarosa.

- Cubetas de electroforesis.

- Fuente de alimentación para electroforesis convencional.

- Transiluminador de UV.

- Equipo fotográfico o de captación de imágenes.

- Nevera (2-8°C).

- Congelador (-20°C).

6.2. MATERIALES

- Tubos tipo Eppendorf de 1,5 y 0,2 ml.

- Gradillas de diferentes formatos.

- Gradillas congeladora (-20°C) y refrigeradora (2-8°C).

- Cajas de congelación para tubos Eppendorf.

- Micropipetas de diferentes volúmenes

- Puntas de micropipeta estériles provistas de filtro a prueba de aerosoles.

- Tubo Vacutainer estéril o tubo con tapón de rosca para recogida de LCR.

- Hisopo (torunda) y un tubo Eppendorf con 500 µL de suero salino estéril para resuspender la muestra (raspado o líquido vesicular).

- Tubo Vacutainer con anticoagulante EDTA o citrato para extracción de la sangre.

- Botellas esterilizadas mediante calor seco para preparar tampones y geles de agarosa.

7. PROCEDIMIENTO

7.1. EXTRACCIÓN DE ADN.

Para la extracción de ADN de las muestras se utilizará el "kit QIAamp DNA Blood" para sangre, suero y LCR. Para biopsias cutáneas se utilizará el kit "QIAamp DNA Tissue". En ambos casos se segurán las instrucciones del fabricante.

7.2. AMPLIFICACIÓN.

7.2.1. Controles necesarios.

- Control positivo: ADN de Rickettsia a una dilución límite de detección para comprobar la eficacia de la amplificación de la PCR.

- Control negativo de extracción: extraer una muestra de agua en las mismas condiciones y a la vez que se extraen las muestras para analizar. Este control permite comprobar la ausencia de contaminaciones durante el proceso de extracción.

- Control negativo de PCR: se amplifica una muestra del agua estéril. Este control permite comprobar la ausencia de contaminaciones durante el proceso de amplificación.

- Para confirmar que el ADN se ha extraído correctamente y que no existen inhibidores en la muestra que impidan el proceso de amplificación, debe amplificarse en cada una de las muestras un control interno, por ejemplo el de la betaglobina que amplifica un fragmento de 150 pb (iniciadores: sense-CATGCCTCTTTGCACCATTC y antisense-TGGTAGCTGGATTGTAGCTG).

7.2.2. Condiciones de la PCR.

- Un ciclo de desnaturalización a 95ºC durante 2 min.

- 40 ciclos de los siguientes pasos:

1. Desnaturalización a 95ºC durante 30 s.

2. Hibridación a 45ºC durante 30 s.

3. Extensión a 65ºC durante 55 s.

- Un ciclo para completar la extensión de los productos de PCR. Consiste en una incubación a 72ºC durante 3 min.

7.3. ELECTROFORESIS.

- Preparar del gel de agarosa al 1% en de tampón TBE 1x.

- Cargar el gel, añadiendo previamente el tampón de carga a las muestras. Utilizar uno de los pocillos para cargar el marcador de tamaño molecular.

- Conectar la fuente de electroforesis de manera que no se sobrepasen 5 V/cm (considerando la distancia más corta entre los electrodos). Lo habitual es que se conecte a 100-150 V.

- Desconectar la fuente cuando el colorante azul de bromofenol esté aproximadamente a la mitad del gel (aproximadamente 1 hora). Para visualizar los amplicones depositar el gel sobre un transiluminador con luz ultravioleta en un lugar oscuro.

7.4. LECTURA E INTERPRETACIÓN

Para validar los resultados del ensayo, en la carrera del control negativo no debe aparecer ninguna banda y en la del control positivo debe aparecer una banda de 380 pb. Para poder interpretar si ha habido amplificación en las muestras, debe aparecer en cada una de ellas la banda correspondiente al amplificado de control interno.

7.5. PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO AMPLIFICADO Y SECUENCIACIÓN

El producto amplificado se purifica cortando la banda a partir del gel de agarosa y utilizando el kit "QUIAquick gel extraction kit", siguiendo las recomendaciones del fabricante. Posteriormente, se somete a una nueva amplificación con concentraciones limitantes de dideoxinucleótidos marcados (secuenciación unidireccional). Se utiliza el kit "BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing v2.0 Ready Reaction" con los mismos oligonucleótidos que los usados en la fase de amplificación, a razón de 3 pmol por reacción de secuencia. Mediante el empleo de un secuenciador automático los amplificados se resuelven mediante electroforesis capilar, obteniéndose un cromatograma con la secuencia de bases.

Finalmente, la secuencia de ácidos nucleicos se edita y se compara, mediante el empleo de un software específico, programas de alineamiento utilizando secuencias de referencia o bien mediante comparación on line con secuencias de bases de datos (Blastn).

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Los resultados de PCR se expresan en términos cualitativos de positivo o negativo. Los datos de secuencia permiten identificar la especie implicada.

Cuando se notifica un resultado de PCR negativo se debe tener en cuenta que, en ocasiones, la carga bacteriana en algunas muestras suele ser muy baja y por tanto los métodos moleculares pueden no ser suficientemente sensibles, por lo que un resultado negativo no descarta una infección.

9. RESPONSABILIDADES

Básicamente son las siguientes:

- Personal del área de recogida y procesamiento de muestras: recepción, identificación y procesamiento de las muestras, rechazo de las muestras remitidas en condiciones defectuosas y adopción de medidas correctoras.

- Personal técnico: control de las muestras, solicitudes y hojas de trabajo, realización de la técnica, lectura y registro de resultados, archivo de hojas de trabajo.

- Facultativo responsable: supervisión del trabajo y de los resultados, resolución de dudas técnicas, adopción de medidas correctoras en el caso de que se hayan cometido errores, firma del informe de resultados.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO

En el caso de la amplificación del gen gltA que se describe en este procedimiento, la elevada conservación de las secuencias de ADN en las regiones donde se han diseñado los oligonucleótidos permite que se trate de una PCR genérica. Además, la secuenciación del producto amplificado permite diferenciar a nivel de especie. Otros genes comúnmente analizados tienen el inconveniente de que no están presentes en todas las especies. Es el caso de dos genes que codifican sendas proteínas de la membrana externa: rOmpA (presente en todas las especies del grupo de las fiebres manchadas (GFM) excepto R. helvetica, R. australis, R. bellii y R. canadensis) y rOmp B (presente en todas las especies excepto R. helvetica, R. bellii y R. massiliae). También se utilizan el gen que codifica la proteína de 17-kDa (válido para todas las rickettsias del GFM) y el gen D (válido para la mayoría de las especies).

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Si bien la PCR es una prueba ideal para el diagnóstico de estas infecciones, existen algunas desventajas en comparación con el cultivo, como son la limitación para realizar pruebas de sensibilidad a los antibióticos y la imposibilidad de coleccionar los aislados para futuras investigaciones. Se deben establecer algunos parámetros antes de incorporar estas pruebas a los protocolos de diagnóstico clínico de los hospitales, como por ejemplo definir el control interno de inhibición, sensibilidad, especificidad y reproducibilidad de la técnica.

12. BIBLIOGRAFÍA

1. Ge H, Tong M, Jiang J et al. Genotypic comparison of five isolates of Rickettsia prowazekii by multilocus sequence typing. FEMS Microbiol Lett 2007; 271:112-117.

2. Regnery RL, Spruill CL, Plikaytis BD. Genotypic identification of rickettsiae and estimation of intraspecies sequence divergence for portions of two rickettsial genes. J Bacteriol 1991; 173:1576-1589.

3. Roux V, Rydkina E, Eremeeva M et al. Citrate synthase gene comparison, a new tool for phylogenetic analysis, and its application for the rickettsiae. Int J Syst Bacteriol 1997; 2:252-261.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-10
DETECCIÓN DE ADN DE Tropheryma whipplei EN MUESTRAS CLÍNICAS MEDIANTE PCR

1. PROPÓSITO Y ALCANCE
El objetivo del presente documento es describir la metodología que se sigue para la detección cualitativa de ADN de Tropheryma whipplei en distintas muestras clínicas (biopsia duodenal, adenopatías, LCR, etc.) mediante PCR. Se describe el procedimiento a seguir para la realización de dos técnicas de PCR en formato convencional con iniciadores específicos del gen 16S ARNr y hsp65 de T. whipplei.

2. FUNDAMENTO

La enfermedad de Whipple es una infección multisistémica rara, causada por la bacteria recientemente descrita Tropheryma whipplei. La amplificación por PCR con iniciadores específicos permite detectar distintas regiones del ADN de T. whipplei directamente en muestras de biopsias, adenopatías y líquidos estériles. Estas técnicas son por el momento, la únicas disponibles para el diagnóstico de la enfermedad en los laboratorios de microbiología clínica, ya que el cultivo del microorganismo es muy complejo y no hay métodos serológicos fácilmente disponibles.

El procedimiento consta de varias fases: preparación de la mezcla de reacción de PCR, extracción del ADN total de la muestra clínica, realización de la PCR en termociclador, detección de los productos amplificados en geles de agarosa, purificación y secuenciación de los mismos, alineamiento de secuencias en Genebank e interpretación de resultados.

Para evitar falsos positivos se deben analizar dos regiones distintas del ADN de T. whipplei y secuenciar todos los productos obtenidos para asegurar su identidad. En este caso, se analizan una parte del gen que codifica para el ARN ribosómico 16S de T. whipplei (este gen se encuentra en varias copias dentro del genoma) y un fragmento del gen que codifica para la proteína de choque térmico 65 de T. whipplei. Esta última se detecta mediante una PCR "semianidada". Además se detectará el gen de la ß-globina humana, como control positivo de una correcta extracción de ADN de las muestras procesadas.

3. DOCUMENTOS DE CONSULTA

- Manual de instrucciones del kit de extracción: QuiAmp DNA Minikit (Quiagen®).

- Manual de instrucciones del kit de purificación de productos de PCR: High Pure PCR product purification Kit (Roche®).

- Manual de instrucciones de los termocicladores, microcentrifugas, fuentes y cubetas de electroforesis).

- Normas de gestión de residuos.

- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 1a de "Recogida, transporte y procesamiento general de las muestras en el laboratorio de microbiología", 2003.

- Procedimiento en Microbiología Clínica de la SEIMC nº 10 de "Seguridad en el laboratorio de microbiología clínica", 2000.

- Registro de calibraciones de los termocicladores.

4. MUESTRAS

4.1. VOLANTE DE PETICIÓN

El volante de petición que acompaña a cada muestra debe estar estrictamente cumplimentado y en el deberá constar la filiación, edad, número de historia, servicio de procedencia, tipo de muestra (de forma muy específica), tratamiento previo y diagnóstico del enfermo, así como el código del clínico que realiza la petición.
Si se envían muestras desde otros hospitales, es conveniente que estos establezcan previamente contacto telefónico con el facultativo responsable de la realización de la técnica.

4.2. TIPOS DE MUESTRAS

Las muestras más utilizadas para el cultivo microbiológico de Bartonella spp. son las biopsias (ganglios o adenopatías, válvulas cardíacas, piel, etc.) y el hemocultivo (pacientes inmunodeprimidos o con sospecha de endocarditis).

4.3. TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN

El rendimiento de las técnicas a realizar depende, en gran medida, de una correcta manipulación y conservación de las muestras.
Las muestras se deben recoger asépticamente y a ser posible antes del inicio del tratamiento antibiótico. Se deben introducir en contenedores estériles de tamaño adecuado y deben enviarse rápidamente al laboratorio de microbiología clínica, sin añadir conservantes ni aditivos, aunque se pueden introducir en suero salino estéril, para evitar su desecación si el envío se va a demorar.
Es conveniente procesar las muestras de forma rápida. Se deben conservar a 4ºC hasta su análisis y durante un máximo de unos 3 días. Si no es posible realizar la extracción de ADN con rapidez o se van a enviar las muestras a un laboratorio externo, se deben conservar congeladas a -20ºC o -70ºC hasta su análisis. Las muestras no se deben someter a ciclos de congelación y descongelación (una vez congeladas sólo se deben descongelar para realizar la extracción del ADN). En todos los pasos de obtención y manipulación de las muestras, se deben seguir normas de bioseguridad adecuadas.
El líquido articular y la sangre periférica se deben enviar en tubos con anticoagulante EDTA. Si se emplea sangre periférica, se debe analizar en su totalidad y no solamente el suero. Es preferible no emplear tubos con heparina, ya que inhibe la Taq ADN polimerasa.

4.4. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN Y RECHAZO

Deben ser cuidadosamente observadas las siguientes incidencias relacionadas con la muestra:

1ª Muestras mal identificadas.

2ª Mala conservación (temperatura inapropiada, muestras en medio no apropiado).

3ª Muestras deterioradas (biopsias secas, muestras derramadas, etc.).

4ª Muestra insuficiente para las determinaciones solicitadas.

Todas estas incidencias deben comunicarse al servicio peticionario, indicando si se realizará el procesamiento o no de la muestra y notificando las incidencias en el volante de resultados y las precauciones necesarias a la hora de interpretar los resultados obtenidos.

5. REACTIVOS Y PRODUCTOS

5.1 EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Se puede emplear cualquier método convencional de extracción y purificación de ADN, por ejemplo el método de fenol-cloroformo ya descrito en otros procedimientos (ejemplo PNT-VIR-07).
Por su sencillez, recomendamos los métodos comerciales, basados en la extracción con columnas tipo QIAmp DNA Minikit (Quiagen?).
En caso de muestras incluidas en parafina, éstas se lavarán con xileno y etanol absoluto, antes de la etapa de extracción con columnas.

5.2 REACCIÓN DE AMPLIFICACIÓN

Notas: Los iniciadores se preparan en solución stock de 100 µM a partir del liofilizado y se conservan a -20ºC.

*Entre paréntesis figuran las concentraciones de la solución de trabajo de cada reactivo.

** Se empleará el tampón adecuado para la Taq ADN polimerasa que se utilice.

Todos los reactivos se conservarán en alicuotas a -20ºC. A la hora de preparar las distintas "master mixes" se debe considerar, que hay que emplear tantos tubos como muestras se procesen, una dilución 1/10 de cada una de las muestras, un control negativo cada 5 muestras, un control negativo de extracción y un control positivo.

Iniciadores de PCR :

5.3. DETECCIÓN DE AMPLICONES

· Agarosa: Preparar un gel de agarosa al 1,4% en tampón TBE 1x, de tamaño adecuado a la cubeta de electroforesis que se utilice.

· TBE 1X: 100ml de TBE 10X comercial+ 900 ml del agua destilada.

· Bromuro de etidio: solución stock de 10mg/ml. Conservar a 4ºC protegido de la luz. Se añaden 5 µl a cada 100 ml de suspensión de agarosa. Manipular siempre con guantes, es un reactivo tóxico.

· Marcadores de peso molecular (100pb)

· Agua destilada

· Tampón PBS comercial .

5.4. PURIFICACIÓN DE AMPLICONES

Para la purificación de amplicones previa a la secuenciación, se recomienda el empleo de kit comerciales tipo: High Pure PCR product purification Kit (Roche®).

5.5. SECUENCIACIÓN

Kit de secuenciación de ácidos nucléicos, basado en el método de los dideoxinucleótidos marcados, adaptado al secuenciador disponible.

6. APARATOS Y MATERIAL

- Micropipetas (diferentes en cada área de trabajo).

- Puntas de micropipeta de "calidad molecular" con filtro.

- Gradillas para tubos sarstedt o similares.

- Agitador tipo vortex.

- Tubos de reacción de 1,5 ml de "calidad molecular" (tipo sarstedt).

- Rejillas, Bases, tubos y tapas de PCR adaptados al termociclador.

- Bandeja con hielo.

- Cabina de seguridad biológica.

- Hojas de bisturí estériles.

- Placas de Petri estériles.

- Termobloques.

- Microcentrífuga.

- Termociclador.

- Balanza.

- Matraces y probetas para preparar la suspensión de agarosa.

- Fuente de electroforesis, bandejas y cubetas.

- Horno microondas o baño de agua caliente.

- Sistema de visualización de geles con transiluminador UV.

- Secuenciador automático de ácidos nucleicos.

7. PROCEDIMIENTO

7.1. PREPARACIÓN DE MUESTRAS

7.1.1. Distribución de áreas de trabajo

Área 1 (Se realizará en primer lugar para no tener que volver a este área)

- Preparación de alícuotas de los reactivos del Kit de extracción en tubos sarstedt.

- Preparación de "master mixes".

- Distribución de "master mix" 16S ARNr, ß-globina y "master mixes" 1 y 2 de la región hsp65 en los tubos y placas de PCR.

Área 2

- Preparación de las muestras, extracción y purificación de ácidos nucleicos.

- Incorporación del ADN extraído a las los tubos que contienen cada "master mix".

Área 3

- Reacciones de amplificación

- Detección de amplicones

- Purificación de amplicones

- Reacciones de secuenciación

7.1.2. Preparación de reactivos

Área 1

- Preparación de alícuotas de los reactivos del kit de extracción en tubos sarstedt.

- Preparación de "master mixes" (gen 16S ARNr, ß-globina, "master mix" 1 y 2 de hsp65). Para realizar los cálculos conviene tener en cuenta el número de controles positivos y negativos que se van a utilizar.

- Distribución de "master mixes" en los tubos y placas de PCR (se añadirán 45 µl de cada una de las 3 "master mixes" 16S ARNr, ß-globina y "master mix" 1 de hsp65, a tubos de PCR de placas separadas y 49 µl a los tubos de la placa de PCR que contiene la "master mix" 2 de hsp65).

Los tubos con la "master mix" 1 de hsp65 y la de ß-globina se pueden colocar en la misma placa de PCR, ya que comparten secuencia térmica de amplificación. La preparación de las "master mixes" se debe realizar en hielo y las placas de PCR se deben conservar refrigeradas hasta su utilización (no más de 4 horas). La placa que contiene la "master mix" 2 de la región hsp65 se puede conservar congelada hasta su utilización (no más de una semana).

7.1.3. Preparación de muestras

Las muestras se deben procesar en el área 2 y en campana de flujo laminar de nivel de bioseguridad adecuado. Todas las muestras se deben atemperar antes de su procesamiento. Las muestras líquidas (sangre, LCR, líquido articular, etc.) se deben homogenizar completamente. Las muestras de tejido se fragmentarán y homogenizarán con un bisturí sobre una placa Petri estéril en condiciones asépticas. Una vez homogenizada, la muestra se introducirá en tubos sarstedt rotulados adecuadamente. Es conveniente conservar un fragmento de muestra por si son necesarios análisis posteriores.

En caso de muestras incluidas en parafina, éstas se lavarán con xileno y etanol absoluto, antes de la etapa de extracción con columnas:

- Dividir la muestra en fragmentos pequeños e introducir en tubo sarstedt. - Añadir 1,5 ml de xileno y agitar en vortex a máxima velocidad 3 min..

- Centrifugar a 13.000 rpm 5 min.

- Retirar el sobrenadante y repetir una vez más.

- Añadir etanol absoluto al pellet y agitar en vortex 3 min.

- Centrifugar a 13.000 rpm 5 min.

- Retirar el sobrenadante de etanol y repetir una vez más.

- Dejar evaporar el etanol retenido por el pellet y lavar con PBS.

- Centrifugar a 13.000 rpm 5 min.

- Retirar el PBS y procesar como el resto de biopsias.

Las muestras recibidas en formol se lavarán 2 veces con tampón PBS antes de la extracción del ADN.

7.2. EXTRACCIÓN DE ADN

Si se emplean métodos comerciales, se debe seguir las recomendaciones del fabricante para la extracción de ADN de tejidos, líquidos biológicos o sangre. Es conveniente prolongar la incubación con proteinasa K, hasta la lisis completa de la muestra (alrededor de 2,5 h). Los líquidos se centrifugarán (1 ml) en un tubo tipo sarsted de fondo cónico, a 13.000 rpm durante 10 min. Se analizarán pellet y sobrenadante por separado (la totalidad del pellet y 500 µl de sobrenadante).

Se debe extraer al menos una muestra libre de ADN de T. whipplei como control negativo de extracción.

7.3. AMPLIFICACIÓN Y REAMPLIFICACIÓN DE ADN DE T. whipplei POR PCR

Controles: en cada placa de PCR se introducirá un control negativo (agua bidestilada estéril y libre de nucleasas) cada 5 muestras, un control positivo (muestra previamente positiva o plásmido construido a tal efecto) y controles negativos de extracción.

· Gen 16S ARNr

- Distribuir 45µl de "master mix" en cada tubo de la placa de amplificación (en área 1 y en hielo).

- Añadir 5µl del ADN extraído, una dilución 1/10, controles negativos y positivos a los distintos tubos de la placa de PCR que contienen la "master mix" (en área 2 y en hielo).

- Tapar los tubos e introducir la placa en el termociclador, con el siguiente programa de PCR:

- Desnaturalización inicial, 94ºC 5 min.

- 40 ciclos de PCR: desnaturalización 94ºC 1 min., anillamiento 60ºC 1 min., elongación 72ºC 1 min.

- Elongación final: 72ºC 10 min.

- Refrigeración 4ºC

· "Master mix" 1 de hsp65 y ß-globina

- Distribuir 45 µl de la "master mix" 1 de hsp65 en cada tubo de la placa de amplificación y en paralelo otros 45 µl de la "master mix" de ß-globina (en área 1 y en hielo).

- Añadir 5 µl del ADN extraído, una dilución 1/10, controles negativos y positivos, en cada tubo de la placa de PCR que contiene 45 µl de cada "master mix" (en área 2 y en hielo). En la PCR de ß-globina no es necesario incluir una dilución 1/10 de cada muestra.

- Tapar los tubos e introducir la placa en el termociclador, con el siguiente programa de PCR.

- Desnaturalización inicial: 94Cº 5 min.

- 40 ciclos de PCR: desnaturalización 94ºC 1 min., anillamiento 57ºC 1 min., elongación 72ºC 1 min.

- Elongación final: 72ºC 10 min.

- Refrigeración 4ºC.

· "Master mix" 2 de hsp65

- Distribuir 49 µl de la "master mix" 2 de hsp65 en cada tubo de la placa.

- Congelar hasta que termine la primera amplificación.

- Añadir 1 µl del producto de amplificación de la "master mix" 1 hsp65. Incluir un nuevo control negativo y positivo en cada tubo de la placa de PCR (en área 3 y en hielo).

- Tapar los tubos e introducir la placa en el termociclador, con el siguiente programa de PCR:

- Desnaturalización inicial: 94ºC 5 min.

- 30 ciclos de PCR: desnaturalización 94Cº 1 min., anillamiento 60ºC 1 min., elongación 72ºC 1 min.

- Elongación final: 72ºC 10 min.

- Refrigeración 4ºC.

7.4. DETECCIÓN DE LOS PRODUCTOS DE AMPLIFICACIÓN

- Preparar un gel de agarosa al 1,4 % en TBE 1x y con bromuro de etidio e introducirlo en una cubeta de electroforesis con TBE 1x.

- En tubo sarstedt añadir 2µl de buffer de carga a 10 µl de muestra (productos amplificados de las distintas PCR's).

- Cargar 10µl de cada una de las muestras en el gel, incluyendo el marcardor de 100 pb.

- Correr el gel a 100V hasta que el frente alcance el borde del mismo.

- Visualizar el gel con transiluminador UV.

7.4.1. Lectura e interpretación de resultados

- En la calle del gel correspondiente a los controles negativos, no debe observarse ninguna banda de amplificación. Si aparece indica contaminación de la PCR y el ensayo no se debe considerar válido. Todos los controles positivos, deben presentar una banda de amplificación de tamaño adecuado (16S ARNr: 284 pb, hsp65-1: 500 pb, hsp65-2: 357 pb). En el control positivo de la 2º PCR de hsp65 se pueden detectar 2 bandas de amplificación de 500 pb y 357pb o una banda de 357pb. Todas las muestras deben presentar la banda de amplificación del gen de la ß-globina (400 pb), en caso contrario las muestras estarán inhibidas y debe repetirse la PCR con una nueva extracción de ADN. Para que una muestra se considere positiva, debe presentar amplificación en las dos regiones del ADN de T. whipplei analizadas (16S ARNr y hsp65) y todos los controles deben ser positivos o negativos como corresponda.

7.5. PURIFICACIÓN DE AMPLICONES

Una vez obtenida amplificación para una muestra determinada, se purificarán los amplicones correspondientes para, posteriormente, realizar las reacciones de secuenciación. Se deben seguir las instrucciones del kit que se emplee.

7.6. SECUENCIACIÓN

Como existen numerosos métodos y aparatos de secuenciación de ácidos nucleicos se deben seguir las instrucciones del fabricante del sistema de secuenciación que se utilice. Escapa al objetivo de este PNT describir la técnica de secuenciación de ácidos nucléicos.

7.7. ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS

Para cada muestra, se debe confirmar la identidad de cada uno de los amplicones obtenidos en el análisis de las dos regiones del ADN de T. whipplei.

Se puede realizar en Genebank usando BLAST (Basic-local-alignment-search-tool) software (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Para ello se copia la secuencia obtenida en formato FASTA, en la sección dedicada a ello de la página de BLAST. Se selecciona la base de datos de nucleótidos y se envía a Genebank, que devuelve por vía electrónica el alineamiento de la secuencia enviada, con las secuencias similares que se encuentran en la base de datos. El sistema proporciona un porcentaje de similitud. La obtención de un alineamiento con un porcentaje de similitud >99%, con una secuencia de la misma región de T. whipplei que la que se ha analizado, se considera que confirma la identidad del amplicón obtenido.

8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS

Las muestras se informarán como positivas: si se detecta una banda de amplificación de 284 pb en la PCR del gen 16S ARNr y bandas de 500 pb y 357 pb en las PCRs hsp65 1 y 2, en la muestra sin diluir y/o diluida 1/10. El alineamiento de las secuencias de los amplicones obtenidos, debe tener una identidad > 99% con una secuencia de la misma región de T. whipplei y la PCR del gen de la ß-globina debe presentar una banda de 400 pb para cada muestra.

La muestras se informarán como negativas: si no se obtienen bandas de amplificación en las PCRs del gen 16S ARNr ni hsp65 y se obtiene una banda de 400 pb. en la PCR de la ß-globina.

Las muestras se considerarán inhibitorias: si no aparece banda de amplificación de 400 pb. en la PCR de la ß-globina, aún después de una nueva extracción y repetición de la PCR. Si aparecen bandas de amplificación en los controles negativos el ensayo se considerará inválido (por posible contaminación del proceso) y se repetirá de nuevo. Si los controles positivos no presentan amplificación, se considerará que ha habido algún error de procesamiento y se repetirá el análisis.

9. RESPONSABILIDADES

El proceso de recogida de la muestra es responsabilidad del servicio solicitante. La información sobre las normas de recogida, transporte y conservación de las muestras y su distribución a los servicios solicitantes es responsabilidad del laboratorio de microbiología.

Área de recogida y procesamiento de muestras del laboratorio de microbiología: recepción, identificación y procesamiento de las muestras. Rechazo de las muestras remitidas en condiciones defectuosas (medios de transporte inadecuados, derramadas) y adopción de medidas correctoras.

Personal técnico: realización del procesamiento de las muestras y técnicas de PCR. Registro de resultados. Archivo de hojas de trabajo. Archivo de alícuotas de ADN o muestras.

Facultativo responsable: supervisión del trabajo, alineamiento de secuencias e interpretación de resultados. Resolución de dudas técnicas. Resolución de errores cometidos. Emisión y validación de informes de resultados. Interconsultas.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO

Todo el personal del laboratorio deberá conocer y seguir las normas generales de bioseguridad e higiene, así como las normas de trabajo en laboratorios de biología molecular. Todas las manipulaciones deben realizarse con guantes.

Es importante considerar que para la obtención de resultados correctos en un laboratorio de diagnóstico molecular en el que se realizan técnicas de PCR, se debe distribuir el trabajo en 3 áreas perfectamente diferenciadas:

- Area 1 o zona limpia: dedicada a la preparación de reactivos. En la que no se introducirán muestras ni reactivos que contengan ADN, tanto amplificado como no amplificado. En este área se preparan las mezclas reacción ("master mix") de la PCR.

- Área 2 o de manipulación de muestras y extracción de ADN. En este área se procesan las muestras, se realiza la extracción y purificación del ADN y se añade el ADN a la "master mix". En esta zona no se debe introducir ADN amplificado.

- Área 3 o de amplificación. En este área se detectan y procesan los productos de PCR (carga de geles, purificación, etc.).

En cada zona de trabajo debe existir material independiente (puntas de micropipeta, micropipetas, guantes, etc.). No se debe trasladar el material de una zona a otra, salvo el estrictamente necesario. El flujo de trabajo debe ser: área 1->2->3 y nunca a la inversa. Es importante que para el manejo del material que esté en contacto con bromuro de etidio, se usen siempre guantes y se extremen las precauciones de seguridad, ya que es un reactivo muy tóxico. La visualización de geles con transiluminador UV, debe realizarse con caretas protectoras o en sistema cerrado de visualización de geles.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

El resultado obtenido depende en gran medida de la calidad de la muestra remitida. Las muestras de sangre periférica y las enviadas en parafina o tratadas con formol, en general tienen bajo rendimiento de amplificación.

Los resultados obtenidos en las PCRs dependen en gran medida de la realización de las técnicas en hielo.

Se desconoce la utilidad de estas técnicas en pacientes en tratamiento.

Se recomienda no rechazar muestras sin consultar previamente con el clínico responsable del paciente.

Ocasionalmente, se pueden producir inhibiciones de la PCR que no permitirán obtener un resultado y que se detectarán por falta de amplificación del gen ß-globina humana. En estos casos se repetirá de nuevo el procedimiento desde el principio, volviendo a extraer el ADN de la muestra si es posible o en su caso analizando el mismo ADN y una dilución 1/10. Si aún así no se consigue obtener amplificación el resultado será de: muestra inhibitoria.

Excepcionalmente, se pueden obtener resultados discordantes entre las PCRs de las distintas regiones analizadas. Si una de las dos regiones analizadas aparece como positiva y la otra como negativa o si las secuencias no presentan identidad con T. whipplei, se repetirá el análisis con un nuevo fragmento de muestra. Si aún así, se obtienen resultados discordantes, se informará cada PCR como positiva o negativa según corresponda y se recomendará interpretar los resultados con precaución (para su interpretación se deberán considerar los datos clínicos del paciente, los resultados de la tinción de PAS de las muestras, los resultados de PCR de otras muestras del mismo paciente, etc.) y si está disponible se podrá analizar una tercera región del genoma de T. whipplei.

12. BIBLIOGRAFÍA

1. Fenollar F, Raoult D. Molecular techniques in Whipple's disease. Expert Rev Mol Diagn 2001; 1:299-309.

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3. Morgenegg S, Dutly F, Altwegg M. Cloning and sequencing of a part of the heat shock protein 65 gene (hsp65) of "Tropheryma whippelii" and its use for detection of "T. whippelii" in clinical specimens by PCR. J Clin Microbiol 2000; 38:2248-2253.

4. Relman DA. 1993. PCR-based detection of the uncultured bacillus of Whipple's disease. p. 496-500. In: Persing, DH; Smith, T; Tenover, FC y White, TJ. (Ed.). Diagnostic molecular microbiology principles and applications. American Society for Microbiogy.