| 31. Diagnóstico
microbiológico de las infecciones oculares.
2008 |
| Coordinadora: |
Lorena
López-Cerero |
| Autores: |
Jaime
Etxebarría |
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Lorena
López-Cerero |
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Josep
Mensa |
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DOCUMENTO CIENTÍFICO
1.
INTRODUCCIÓN
La infección ocular es una de las principales causas de
ceguera en los países en vías de desarrollo
esencialmente debido al tracoma. Asimismo, es una infección
relevante en los países occidentales debido a la infección
herpética y, más recientemente, al aumento de las
intervenciones quirúrgicas y las complicaciones asociadas al
uso de lentes de contacto. Para el manejo de estas infecciones es
fundamental establecer el diagnóstico microbiológico
puesto que las manifestaciones clínicas a menudo son inespecíficas.
Por otro lado, el diagnóstico debe obtenerse lo más
pronto posible porque los tejidos oculares son muy vulnerables a la
respuesta inflamatoria y su lesión conduce a la pérdida
irreversible de agudeza visual.
La toma de muestra para análisis
microbiológico, antes de la instauración del tratamiento
antibiótico, figura en todas las recomendaciones para el
abordaje de este tipo de infecciones. No obstante, en la práctica
clínica, la estrategia empleada con mayor frecuencia es el
inicio de una pauta de tratamiento antibiótico empírico,
por las siguientes razones: en primer lugar, la anatomía de las
estructuras oculares no permite el fácil acceso a la toma de
muestras, requiriéndose con frecuencia la punción ocular
para obtener una biopsia o un aspirado. En segundo lugar, el cultivo
de los exudados oculares tiene una sensibilidad baja o moderada, en
torno al 60% en el mejor de los casos, a lo que hay que añadir
la lentitud en conseguir los resultados. Varios estudios sugieren que
rara vez (<10%) este resultado conduce a una modificación
del tratamiento. En estos momentos, carecemos de estudios adecuados
que comparen la terapia empírica frente al coste-beneficio de
un tratamiento basado en datos microbiológicos.
El bajo rendimiento de las muestras clínicas
se debe, en parte, al pequeño volumen de material que puede
obtenerse. El espesor de la córnea en el adulto es de 1 mm en
la región periférica y solamente 0,6 mm en la región
central. En cuanto al vítreo y a la cámara anterior,
suponen un volumen aproximado de 4-5 ml y 1,5-2 ml, respectivamente.
Es necesario emplear métodos de transporte adecuados que eviten
la dilución excesiva, deshidratación o pérdida de
la muestra. Asimismo es importante que exista una buena comunicación
entre el clínico y el laboratorio, ya que son los datos clínicos
los que guiarán la elección de los medios de cultivo más
apropiados y el reparto del escaso volumen de la muestra.
2.
CONSIDERACIONES CLÍNICAS
2. 1. CONJUNTIVITIS
La infección de la conjuntiva es uno de los motivos más
frecuentes de consulta. La etiología más común es
la vírica, seguida por la bacteriana. En nuestro medio la
etiología fúngica o parasitaria es excepcional. La
conjuntivitis vírica, en la mayoría de los casos, tiene
un curso autolimitado y la valoración de la presentación
clínica y las características epidemiológicas en
general hacen innecesario realizar pruebas para establecer el diagnóstico
etiológico salvo en caso de estudios epidemiológicos.
Los virus más frecuentes son adenovirus, virus respiratorios y
virus del grupo herpes.
Las bacterias son responsables del
50-75% de los episodios de conjuntivitis en los que se realiza una
toma de muestra para cultivo. Las conjuntivitis bacterianas se
clasifican, en función de su gravedad en agudas, hiperagudas,
crónicas y las causadas por Chlamydia. La infección
aguda es la más frecuente, con sintomatología de menos
de 3-4 semanas de evolución, y están implicados en su
etiología Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae y en algunas
ocasiones enterobacterias y otros bacilos gramnegativos. Neisseria
gonorhoeae es la causa más frecuente de la forma
hiperaguda, aunque es una entidad rara hoy en día, afecta a
neonatos (oftalmia neonatorum) y en los adultos como
enfermedad de transmisión sexual (ETS). En las conjuntivitis crónicas
se aíslan S. aureus, y Moraxella lacunata, aunque también
se han observado bacilos gramnegativos y Actinomyces spp. Por último,
la infección ocular por Chlamydia en nuestro medio se
manifiesta en el adulto y en el neonato como una conjuntivitis de
inclusión.
2.2. QUERATITIS
La queratitis es una infección del epitelio corneal y con
cierta frecuencia, pero no siempre, de otras capas de la córnea.
Hasta hace unos años, las queratitis de etiología
bacteriana o fúngica eran raras y estaban asociadas a un trauma
ocular o de la superficie corneal. Sin embargo, dos fenómenos
nuevos han hecho variar la incidencia de esta infección: por un
lado, el amplio uso de las lentes de contacto, y por otro, la cirugía
corneal no invasiva fotorrefractiva, aunque esta última
raramente se complica con infección.
La queratitis es 6 veces más
frecuente en portadores de lentes de contacto, debido no sólo a
las posibles escoriaciones y al uso inapropiado por parte del
paciente, sino también a la hipercapnia e hipoxia corneal que
causan las lentes. La composición de la lente también
puede influir. Se ha observado que los trofozoitos de Acanthamoeba
tienen mayor facilidad de adherirse a las lentes de primera generación
de hidrogel de silicona que a las de segunda generación.
Recientemente, el uso de un líquido de conservación de
lentillas, con un alto contenido en polímeros, la contaminación
de algunos lotes y probablemente el empleo inadecuaco por parte de los
usuarios ha facilitado la contaminación por hongos, y se ha
asociado a una epidemia internacional de queratitis por Fusarium
y otros hongos filamentosos.
La mayoría de las queratitis
adquiridas en la comunidad se resuelven con tratamiento empírico
sin necesidad de establecer el diagnóstico microbiológico.
Las características clínicas de las úlceras
permiten en un número elevado de casos (65%), predecir su
etiología, sobre todo cuando están producidas por Pseudomonas
aeruginosa o por Acanthamoeba En general, existe consenso
en que se debe tomar una muestra para examen microbiológico
cuando la úlcera es profunda, mayor de 1x1 mm en extensión,
la lesión está adelgazando la córnea, la
inflamación es significativa, el infiltrado se extiende a la
profundidad del estroma, existe hipopión o necrosis, la úlcera
es crónica, hay sospecha de queratitis fúngica, amebiana
o micobacteriana o el tratamiento empírico fracasa.
La mayoría de las queratitis
infecciosas están causadas por bacterias, predominando los
cocos grampositivos (aproximadamente un 80% de los casos) y entre
ellos los estafilococos coagulasa negativa, y en segundo lugar
enterobacterias y Pseudomonas spp. (10-20%). La incidencia de
queratitis por Acanthamoeba y por hongos es baja en nuestro
medio (1-2%), así como las de etiología mixta (2,5%).
2.3. ENDOFTALMITIS
La endoftalmitis es la inflamación de los fluidos y
tejidos intraoculares. A pesar de un tratamiento adecuado, con
frecuencia conduce a la pérdida total o parcial de la visión.
Los microorganismos pueden alcanzar el globo ocular por dos vías:
1) por inoculación directa en una herida traumática o
post-quirúrgica o a través de una úlcera corneal
o queratitis, o 2) por diseminación hematógena. Los
microorganismos causales y la forma de presentación clínica
difieren en función de la puerta de entrada.
La endoftalmitis postquirúrgica
es la más frecuente, constituyendo hasta un 70% de todas las
formas de endoftalmitis. Es más frecuente tras cirugía
de catarata (0,05%) y tras intervención del glaucoma. Puede
presentarse de forma aguda, dentro de las 6 primeras semanas tras la
intervención, sobre todo entre el tercer y séptimo día
postoperatorio, o de forma tardía, varios meses después
de la cirugía. Los microorganismos más frecuentes en las
formas agudas son los estafilococos coagulasa negativa (>60%),
seguido de S. aureus, S. pneumoniae, estreptococos del grupo
viridans y bacilos gramnegativos en un porcentaje pequeño
de casos. En cambio, en las formas tardías se detectan
microorganismos menos virulentos, como Propionibacterium acnes,
Staphylococcus coagulasa negativa y con menos frecuencia Corynebacterium
spp., y micobacterias atípicas como Mycobacterium chelonae.
Los hongos pueden llegar a representar en algunas series entre el 8 y
el 18% de los casos.
La endoftalmitis postraumática,
secundaria a la penetración en el globo ocular de un cuerpo
extraño, supone el 25% de las endoftalmitis (incluyendo el
trauma rotura de la cápsula del cristalino). Las especies de
Bacilllus, especialmente Bacillus cereus, son los
microorganismos mas frecuentes, causando entre el 28 y el 46% de estas
infecciones, seguido de estafilococos y de infecciones
polimicrobianas.
La endoftalmitis endógena es poco
frecuente, representando el 2-17% de todos los casos, y a menudo se
produce en pacientes inmunodeprimidos o adictos a drogas parenterales.
A diferencia de las otras formas de endoftalmitis, está causada
con mayor frecuencia por hongos que por bacterias. Candida
spp. es el agente aislado en el 35% de todos los casos, y en segundo
lugar Aspergillus spp., que produce el 24%. Dentro de las
formas bacterianas, la incidencia de microorganismos grampositivos y
gramnegativos es similar, destacando S. aureus, estreptococos,
Neisseria meningitidis, enterobacterias y Pseudomonas
aeruginosa.
2.4.
UVEITIS/CORIORRETINITIS
En el curso de un episodio de bacteriemia el microorganismo
puede metastizar en la coroides o la retina. M. tuberculosis,
Treponema pallidum y Borrelia burgdorferi pueden
causar coriorretinitis, tanto en el polo anterior como posterior. Los
virus causales de coriorretinitis y uveitis son el virus del herpes
simple (VHS) (necrosis retiniana), el virus varicela zoster (VVZ), el
citomegalovirus (CMV), el virus de Epstein-Barr (EBV) y el virus de la
rubéola. Varios parásitos pueden producir patología
en la coroides, el más frecuente es Toxoplasma gondii,
aunque también podemos encontrar en nuestro medio Toxocara
spp. y larvas de Taenia solium.
2.5. INFECCIONES DE
ANEXOS OCULARES
2.5.1. Blefaritis. Se trata de la
infección del párpado que puede afectar al margen
anterior o a las glándulas meibomianas. Estas infecciones
suelen relacionarse con alteraciones de las secreciones lipídicas.
Las bacterias aisladas de pacientes con blefaritis incluyen S.
aureus, S. epidermidis, P. acnes y corinebacterias. También
se han observado hongos como Pityrosporum, especialmente en el
caso de blefaritis posterior o meibomianitis, y parásitos como
Demodex folliculorum. Se recomienda un diagnóstico
microbiológico en los casos recurrentes y que no responden al
tratamiento.
2.5.2. Orzuelo. Se trata de un
absceso de la glándula palpebral originado por microbiota cutánea,
principalmente por S. aureus.
2.5.3 Dacriocistitis y dacrioadenitis.
Es la infección del saco y de la glándula lagrimal
respectivamente. La darcriocistitis suele deberse a la obstrucción
del conducto lagrimal inferior. Puede presentarse de forma aguda o crónica,
siendo ésta última la más frecuente. Los
microorganismos relacionados frecuentemente con esta patología
son cocos grampositivos como S. aureus y S. pneumonaie, en
segundo lugar están los bacilos gramnegativos, predominantes en
las formas crónicas, como H. influenzae, Pseudomonas
spp., enterobacterias, y por último en raras ocasiones pueden
estar implicadas micobacterias. La afectación de la glándula
lagrimal con frecuencia es metastásica o secundaria a una
infección diseminada, como mononucleosis infecciosa,
tuberculosis o incluso brucelosis.
2.5.4. Canaliculitis. Es una infección
poco frecuente y se suele presentar en personas de edad avanzada. La
etiología más frecuente son los actinomycetos, sobre
todo Actinomyces israelii, aunque también se pueden
aislar Nocardia spp. y Mycobacterium spp., así
como bacterias anaerobias como Fusobacterium spp.
3.
RECOGIDA DE LA MUESTRA
3.1. EXUDADO CONJUNTIVAL
El exudado conjuntival debe obtenerse antes de la instauración
de tratamiento tópico con colirios. Se frota la conjuntiva
tarsal con un hisopo de Dacron o alginato cálcico conservado en
medio de transporte de Amies. Si la mucosa está seca, hay que
empapar la torunda en caldo triptona-soja (TSB) en caldo infusión
cerebro-corazón (BHI) antes de tomar la muestra. Además,
debe obtenerse una segunda muestra sin medio de transporte para poder
efectuar un examen microscópico. Si se sospecha infección
por Chlamydia hay que tomar una torunda adicional y colocar la
muestra en el medio de transporte específico que utilice el
laboratorio. Del mismo modo en caso de infección vírica
la muestra debe introducirse en medio de transporte adecuado para
virus. Durante la toma de la muestra ha de evitarse el contacto con el
borde del párpado para no arrastrar microbiota colonizante.
3.2. RASPADO CORNEAL
La muestra debe tomarse antes de instaurar el tratamiento antibiótico,
sobre todo si es un colirio. Se calcula que el inóculo
bacteriano en los raspados puede variar entre 100 a 300 UFC en total
de la muestra en un volumen que oscila entre 1 y 3 µL (Kaye,
2003). El inóculo es tan bajo que se afecta de forma
significativa por la presencia de antibióticos tópicos,
reduciendo la sensibilidad del cultivo en un 30-40%.
No existe consenso sobre el instrumento
o el procedimiento a seguir para la toma de muestra. Se pueden
utilizar tanto espátulas de Kimura, hoja Bard-Parker, hojas de
bisturí por el extremo no cortante (número 15), agujas
estériles o bien escobillones empapados en caldo tioglicolato o
una combinación de ambos. La espátula o la hoja de
bisturí permiten desbridar la capa superficial y acceder a los
microorganimos que invaden las capas más profundas. Se debe
raspar tanto el fondo de la úlcera como los bordes.
3.3. BIOPSIA CORNEAL
Está indicada la toma de una biopsia corneal si la infección
no responde al tratamiento o si los cultivos de los raspados han sido
negativos y continúa la sospecha clínica de queratitis
infecciosa. También está indicada si la infección
se localiza en las capas profundas del estroma inaccesibles al
raspado. La biopsia puede realizarse con el microscopio quirúrgico
con una hoja pequeña, utilizando trépanos de 2-3 mm de
diámetro. Se lleva a cabo trepanación no penetrante y
con ayuda de cuchillote o espátula se finaliza la queratectomía
parcial. De forma anecdótica, también se ha utilizado
laser para realizar queratectomías superficiales.
3.4. LENTE DE CONTACTO
El cultivo de la lente de contacto tiene utilidad en los casos de
sospecha de infección por Acanthamoeba spp.
3.5. HUMOR VÍTREO
Las muestras para el diagnóstico microbiológico
deben tomarse antes de la instauración del tratamiento antibiótico,
especialmente si éste se administra mediante inyección
intravítrea. Puede obtenerse una muestra de humor vítreo,
por aspiración con jeringa en el quirófano o
preferentemente por vitrectomía y lavado para evitar tracciones
vítreas. El análisis del humor acuoso tiene una escasa
sensibilidad para determinar la etiología de una vitritis.
3.6. LENTE INTRAOCULAR
Puede cultivarse en los casos de endoftalmitis postquirúrgica
tras implante. Una vez extraída, se introduce en 0,5 ml de
solución salina estéril y se remite al laboratorio.
3.7. EXUDADO PALPEBRAL
Para obtener este exudado se debe frota el borde del párpado
o de la zona ulcerada con una torunda de algodón o alginato cálcico
previamente humedecida en caldo TSB o BHI.
3.8. MUESTRAS DEL
APARATO LAGRIMAL
Si hay exudado purulento procedente del canal o del saco
lagrimal, hay que aspirarlo con jeringa. También se puede
aspirar el material obtenido en el curso de una dacriocistotomía
o canaliculotomía. Si se observan concreciones en el canal
deben extraerse con una espátula o cureta y a continuación
se extienden sobre un portaobjetos para su posterior tinción.
Si se realiza la extirpación del saco o de la glándula
lagrimal, se debe introducir en suero salino estéril para
remitirlo al laboratorio.
3.9. SANGRE
En caso de endoftalmitis hematógena han de practicarse
hemocultivos por punción venosa.
4.
TRANSPORTE Y CONSERVACIÓN DE LA MUESTRA
4.1. EXUDADOS
En general, para el transporte de las muestras se recomienda la
utilización de medios de transporte, como el medio de Amies si
se han utilizado torundas, y su conservación refrigerada (4-8ºC)
hasta el momento de su procesamiento en el laboratorio.
4.2. RASPADO CORNEAL
Tradicionalmente, el raspado de la úlcera se sembraba
directamente en medios sólidos en la misma consulta del oftalmólogo,
debido al volumen de muestra tan pequeño. Esta práctica
presenta varios inconvenientes: 1) hay que mantener varios medios de
cultivo en la consulta, 2) es difícil la siembra en la
superficie del agar utilizando la mayoría de las veces una hoja
de bisturí, sobre todo para personal no experimentado en las técnicas
microbiológicas, 3) el manejo de medios enriquecidos fuera del
ambiente controlado del laboratorio favorece su contaminación,
4) es necesario raspar varias veces la úlcera y a veces no es
posible debido a la delgadez de la córnea, y por último,
3) una vez realizada la siembra hay que enviar las placas con rapidez
al laboratorio para su incubación en una atmósfera
apropiada.
Se ha analizado la alternativa de
utilizar medios de transporte en lugar de la inoculación
directa, obteniéndose un rendimiento similar para la recuperación
de bacterias y hongos, simulando intervalos de 3-4 horas e incluso 24
horas tras la toma de la muestra. Se puede utilizar como transporte un
hisopo en medio Amies o caldo peptonado como el BHI. El medio líquido
presenta la ventaja frente a la utilización de hisopos que
permite una homogeneización una vez que llega al laboratorio,
por lo que se puede realizar un único raspado. A partir del
caldo, una vez homogeneizado, se pueden realizar las extensiones para
el examen microscópico, el subcultivo en varios medios sólidos
y, además, el mismo caldo sirve como medio de enriquecimiento.
4.3. HUMOR VÍTREO
Las muestras de aspirado vítreo o lavados tras vitrectomía
deben remitirse de forma urgente al laboratorio. Una alternativa para
el transporte y posterior cultivo del aspirado vítreo es la
inoculación, directa tras la obtención, en viales de
hemocultivo pediátricos, ya que se trata de muestras con un
escaso volumen.
4.4. MUESTRAS DEL
APARATO LAGRIMAL
Tanto los aspirados como las muestras resultantes de una
extirpación quirúrgica deben remitirse en contenedores
con atmósfera reducida para detección de microorganismos
anaerobios.
4.5. BIOPSIAS Y LENTES
Deben remitirse al laboratorio de forma urgente en contenedor estéril
con una pequeña cantidad de solución salina.
5.
MANEJO DE LA MUESTRA EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
El límite para aceptar muestras de exudados oculares o
intraoculares debe ser un máximo de 24 horas. Las muestras
deben estar correctamente identificadas, acompañadas del
correspondiente volante de solicitud y en el contenedor adecuado. En
caso contrario, deben ser rechazadas para su análisis,
comunicando esta incidencia lo antes posible al remitente. Para más
información sobre este aspecto consultar el PNT-RTP-01 del
procedimiento de "Recogida, transporte y procesamiento general de
las muestras en el laboratorio de Microbiología" (Sánchez
C (Coordinador), Guerrero C, Sánchez C. Recogida, transporte y
procesamiento general de las muestras. Procedimientos en Microbiología
nº 1 a, 2ª edición. SEIMC. 2003).
6.
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
Los exudados palpebrales y conjuntivales se inoculan
directamente en medios sólidos, mientras que en las muestras
corneales, vítreas o del aparato lagrimal debe emplearse además
un caldo de enriquecimiento (TSB, BHI o tioglicolato). Los medios sólidos
se inocularán reaislando al menos en tres estrías para
poder estimar la cantidad de crecimiento. Si se ha empleado un caldo
como medio de transporte, este debe homogeneizarse en vortex antes de
inocularlo en los medios sólidos. En el caso de la lente
intraocular, debe agitarse vigorosamente en vortex en la solución
salina de transporte durante al menos 10 minutos para permitir el
desprendimiento de células. La lente de contacto se raspa con
la hoja de un bisturí por la cara cóncava. El lavado de
humor vítreo debe concentrarse mediante filtración con
filtros estériles de polivinilo de 0,22 µy cultivar el
filtro o mediante centrifugación, lo que permite aumentar la
sensibilidad hasta en un 30-40%.
El examen microscópico es
fundamental en el caso de conjuntivitis hiperaguda, oftalmía
neonatorum, queratitis y endoftalmitis, ya que la evolución de
la infección puede ser muy rápida. La posibilidad de
diferenciar células bacterianas o estructuras fúngicas
puede orientar un tratamiento precoz. También es importante el
resultado de la tinción de Gram en las muestras corneales,
conjuntivales y palpebrales para evaluar la significación clínica
de los aislados y descartar microbiota colonizante.
La tinción de Gram tiene una
sensibilidad baja en los raspados corneales, aproximadamente un 30% en
las úlceras tempranas o pequeñas (< 2 mm) y entre un
40-60% en las úlceras más avanzadas, aunque hay que
tener en cuenta que en muchos casos los pacientes han recibido antibióticos
previamente. La sensibilidad de la tinción de Gram en las
muestras vítreas es también muy baja. Los hongos pueden
detectarse en las muestras de raspado con varios métodos
incluyendo la preparación en fresco con KOH, tinción con
naranja de acridina, azul de lactofenol, Giemsa y calcofluor, con una
sensibilidad que varía entre el 50-80%. En las infecciones del
aparato lagrimal deben de realizarse adicionalmente extensiones para
tinciones de ácido-alcohol resistencia (Ziehl Neelsen, Kinyoun,
auramina-rodamina…)
Si existe sospecha clínica de
queratitis por Acanthamoeba (infiltrado en anillo, portador de
lente de contacto…) se debe realizar un examen en fresco del
raspado o biopsia corneal o del raspado de la lente de contacto,
aunque la sensibilidad es baja. En la preparación en fresco o
con 10% de KOH, Acanthamoeba se reconoce por los quistes de
doble pared característicos, una pared arrugada externa
(ectoquiste) y una interna poligonal (endoquiste). Si se deja
transcurrir el tiempo de la preparación, la morfología
del quiste puede desintegrarse. En caso de sospecha de infección
por Chlamydia, dependiendo de las técnicas disponibles
en el laboratorio, se pueden hacer extensiones para
immunofluorescencia directa, cultivo o detección mediante técnicas
de amplificación de ácidos nucléicos.
7.
SELECCIÓN DE MEDIOS Y CONDICIONES DE INCUBACIÓN.
CULTIVOS.
Los medios de cultivo sólidos deben incluir agar sangre
de carnero 5% (o de caballo), agar chocolate, incubados ambos a 37ºC
en atmósfera con 5% de CO2, y agar MacConkey a 37ºC.
Si se trata de una conjuntivitis hiperaguda o es un recien nacido, se
debe inocular también en medio selectivo para gonococo (agar
Thayer Martin, Martin-Lewis o New York City) e incubar a 37ºC en
atmósfera con 10% de CO2. En caso de sospecha de
infección fúngica opcionalmente se puede añadir
agar Saboureaud incubado a 25-30ºC. En las muestras del aparato
lagrimal hay que incluir medios para anaerobios (agar Schaendler,
Brucella…) e incubación en condiciones de anaerobiosis.
Excepto en las muestras de exudado
palpebral y conjuntival, el resto de las muestras oculares deben
inocularse en caldo de enriquecimiento, incubado a 37ºC y un mínimo
de 5 días y si existe sospecha de hongos a 25ºC durante un
periodo entre 5 y 14 días. En los casos de canaliculitis y
sospecha de actinomicosis hay que mantener la incubación dos
semanas. Existen varios estudios que demuestran que la incorporación
de un medio líquido, a los medios sólidos tradicionales,
incrementa el rendimiento del cultivo bacteriano en un 20-30%. Los
medios líquidos empleados varían entre los diferentes
estudios. Se han utilizado caldos peptonados de fabricación
casera, tioglicolato, BHI comercial y también medios
comerciales de sistemas automáticos como el BACTEC Peds Plus,
aunque no existen análisis comparativos entre los distintos
medios de enriquecimiento.
Acanthamoeba spp. puede
recuperarse fácilmente a partir de agar no nutriente (medio
salino de Page) o que contenga bajas concentraciones de nutriente
(0,05% de peptona, 0,05% de extracto de levadura, 0,1% de glucosa) en
presencia de bacterias y a 30ºC. En general, se deben usar cepas
no mucosas de Escherichia coli, Enterobacter spp. o Klebsiella
spp. debido a que la presencia de la cápsula mucosa impide la
fagocitosis amebiana. La presencia de amebas puede detectarse
examinando la superficie del agar con un microscopio convencional,
invirtiendo la placa, y enfocando con el objetivo de 10X. Las amebas
empiezan a cubrir la superficie del agar en uno o dos días, por
lo que los cultivos deben examinarse cada día y se deben
descartar como negativos a los 7 días.
8.
CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
El examen microscópico de las muestras permite valorar la
significación de los aislados, especialmente cuando se trata de
microorganismos propios de la microbiota cutánea del párpado.
Aunque no disponemos de estudios que hayan analizado de forma
cuantitativa la correlación entre la tinción, el
recuento bacteriano y el cuadro clínico, la visualización
de bacterias en las tinciones indica un inóculo significativo.
La presencia de leucocitos y bacterias intracelulares también
son indicativos de infección por esos microorganimos. Se valora
siempre la presencia de patógenos como S. aureus, S.
pyogenes, S. pneumoniae, P. aeruginosa, N. gonorrhoeae, H. influenzae,
P. acnes, Actinomyces spp., Nocardia spp.,
levaduras y hongos filamentosos. En muestras del aparato lagrimal se
valorará la presencia de microbiota mixta anaerobia. En las
muestras intraoculares y biopsias todos los aislados son
significativos. La detección de C. trachomatis es
siempre significativa.
Con frecuencia se aíslan
bacterias procedentes del borde palpebral a partir de conjuntiva sana.
En la mucosa sin infección se encuentran estafilococos
coagulasa negativa y corinebacterias, pero también patógenos
tradicionales como estafilococos, estreptococos, Haemophilus y
Moraxella. En situaciones de no infección, la cantidad
presente de estas bacterias en la conjuntiva es pequeña,
generalmente produciendo menos de 10 colonias en la placa de cultivo,
mientras que en los casos de conjuntivitis aguda se obtiene un
crecimiento confluente.
Para valorar los cultivos corneales se
deben tener en cuenta las siguientes situaciones: en primer lugar que
un resultado negativo no descarta el origen infeccioso de la úlcera,
y en segundo lugar que la superficie de la córnea puede estar
cubierta transitoriamente de microbiota vehiculizada por el flujo
lagrimal. No es posible detectar el agente causal en aproximadamente
el 35-60% de los pacientes con sospecha de queratitis infecciosa,
posiblemente debido al insuficiente material que se puede obtener, el
retraso en la toma de muestra o el uso previo de antibióticos.
La sensibilidad del cultivo disminuye cuando se trata de infecciones fúngicas
respecto a las bacterianas. En general, las úlceras corneales
de mayor tamaño (>2 mm) proporcionan suficiente material
para el análisis microbiológico, tanto la extensión
para tinciones como para el cultivo. Para considerar como relevante un
aislado, especialmente cuando se trata de estafilococos coagulasa
negativa o estreptococos del grupo viridans, debe ser en cultivo puro
y coincidir con los hallazgos del examen microscópico o
detectarse en varios medios de cultivo o en varios raspados.
9.
PROCEDIMIENTOS ADICIONALES A REALIZAR EN SITUACIONES ESPECIALES
9.1. CULTIVO DE MICOBACTERIAS
En lesiones oculares crónicas con reiterados cultivos
negativos y sospecha de etiología infecciosa se debe incluir el
cultivo del material en medio para micobacterias (ver PNT-BK-03 y 04;
Alcaide F (Coordinador), Alcaide F, Esteban J, González Martín
J, Palacios JJ. Micobacterias, Procedimientos en Microbiología
nº 9 a, 2ª edición. SEIMC. 2005. Disponible en
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia)
para el cultivo de micobacterias en medio sólido y líquido.
9.2. SEROLOGÍA
El diagnóstico de coroiditis y retinitis se basa
habitualmente en la presencia de características clínicas
en la coroides y la retina, la recuperación de microorganismos
en sangre mediante hemocultivo o la demostración de títulos
elevados o seroconversión a patógenos como VVZ, CMV,
EBV, T. pallidum, B. burdorferi, T. gondii y Toxocara spp.
También es posible realizar la biopsia retiniana con objeto de
detectar virus de la familia de los herpesvirus en cuadros de necrosis
retiniana.
10.
INFORMACIÓN DE RESULTADOS
Una vez valorado un aislado como significativo, se debe llevar a
cabo la identificación y estudio de sensibilidad en el caso de
etiología bacteriana o fúngica. Es importante considerar
que los niveles antibióticos que se alcanzan con la
administración tópica o subtenal son superiores a los séricos,
por lo que el valor de la CMI convencional tiene poco valor cuando se
va a emplear ésta vía.
Debido a la importancia en las
infecciones oculares de un adecuado tratamiento precoz, ante la
detección de microorganismos intracelulares, levaduras, hifas o
quistes amebianos mediante el examen microscópico debe emitirse
un informe preliminar de forma urgente. En los cultivos en los que se
aísla microbiota comensal del área palpebral se informará
como "microbiota habitual saprofita" y si el cultivo es
negativo como "no se aíslan microorganismos".
11.
TÉCNICAS RÁPIDAS DE DIAGNÓSTICO
Métodos moleculares
Existen varios motivos que justifican el empleo de la PCR en las
infecciones oculares fúngicas. En primer lugar, la sensibilidad
del cultivo en los casos de endoftalmitis no es superior al 70% y en
las queratitis no supera el 75-80% debido al escaso inóculo. En
segundo lugar, el procedimiento de cultivo e identificación
puede requerir más de una semana, lo que demora la instauración
precoz de un tratamiento adecuado. Por último, es importante
evitar la utilización innecesaria de antifúngicos de
forma empírica dados los efectos tóxicos de muchos de
ellos. Como contrapartida, la utilización de métodos
moleculares no permite el estudio de sensibilidad ni la recuperación
del aislado con fines epidemiológicos.
En estos momentos, la PCR para hongos
ofrece como prestaciones una mayor sensibilidad que el cultivo, el
diagnóstico de infección fúngica en el mismo día
de la toma de muestra y, según el procedimiento llevado a cabo,
la identificación de especie en 24 horas. Actualmente no está
disponible ninguna técnica comercial validada ni tampoco PCR en
tiempo real, pero existe experiencia clínica de varios métodos
caseros de PCR convencional en el diagnóstico de infección
por Scedosporium spp., Candida spp. y Aspergillus
spp. Estos métodos se basan en la amplificación de las
regiones espaciadoras entre los genes ARNr fúngicos, la ITS1 e
ITS2, utilizando cebadores que reconocen secuencias conservadas en
todos los hongos al final de la subunidad 18S y al principio de la
subunidad 28S. En un segundo paso, el análisis de la región
ITS2/5,8S ARNr, bien mediante secuenciación o mediante
polimorfismo de restricción, permite la identificación
de especie gracias a su variabilidad.
La emergencia actual de queratitis por
Acanthamoeba spp. y la gravedad de estas úlceras han
motivado el diseño de métodos moleculares de diagnóstico.
Las lesiones producidas por este parásito no siempre tienen una
morfología típica en estadios precoces, pudiéndose
confundir con queratitis víricas y retrasándose el
tratamiento correspondiente. Actualmente no existe un método
comercial validado, pero se han diseñado procedimientos de PCR
en tiempo real con sondas TaqMan dirigidas a secuencias específicas
de la fracción 18S del ARNr. Estas técnicas permiten
detectar un bajo número de quistes y trofozoitos en lesiones de
portadores de lentes de contacto.
12.
PROCEDIMIENTOS NO ACEPTABLES No deben admitirse muestras si
han transcurrido más de 24 horas de la toma y sin medio de
transporte. No deben procesarse especimenes para la investigación
de anaerobios si ha transcurrido más de una hora desde la toma
o si ésta no se ha conservado en el adecuado medio de
transporte reducido. El cultivo de las lentes de contacto o del
contenido de las cajas conservadoras de lentes no aporta nada el diagnóstico
microbiológico de la queratitis bacteriana o fúngica.
Los líquidos conservantes o la superficie de la lente de
contacto pueden estar contaminados por microbiota mixta saprofita
debido a las costumbres higiénicas del usuario y al contenido
del líquido. En menos del 25% de los casos coincide el
microorganismo aislado en la lente o en el líquido de lentillas
con el aislado de la úlcera corneal.
13.
BIBLIOGRAFÍA
- American Academy of Ophthalmology. Summary benchmarks for
preferred practice pattern guidelines. November 2008.
http://one.aao.org
- Callegan MC, Engelbert M, Parke II DW, Jett B, Gilmore M.
Bacterial endophtalmitis: epidemiology, therapeutics, and
bacterium-host interactions. Clin Microbiol Rev 2002; 15: 111-124.
- Chang Dc, Grant GB, O´Donnell K, et al. for the Fusarium
keratitis Investigation Team. Multistate outbreak of Fusarium
keratitis associated with the use of a contact lens solution. JAMA
2006; 296: 953-963.
- Dahlgren M, Lingappan A, Wilhelmus K. The clinical diagnosis of
microbial keratitis. Am J Ophthalmol 2007; 143: 940-944.
- Jackson WB. Blepharitis: current strategies for diagnosis and
management. Can J Ophtalmol 2008; 43: 170-179.
- Kaye SB, Rao PG, Smith G, Scott JA, Hoyles S, Morton CE,
Willoughby C, Batterbury M, Harvey G. Simplifying collection of
corneal specimens in cases of suspected bacterial keratitis. J Clin
Microbiol 2003; 41: 3192-3197.
- Kratz A, Levy J, Belfair N, Weinstein O, Klemperer I, Lifshitz T.
Broth culture yield vs traditional approach in the work-up of
endophthalmitis. Am J Ophthalmol. 2006; 141: 1022-1026.
- Keay L, Edwards K, Naduvilath T et al. Microbial keratitis:
predisposing factors and morbidity. Ophthalmology 2006; 113:
109-116.
- Klotz SA, Penn C, Negvesky G, Butrus SI. Fungal and parasitic
infections of the eye. Clin Microbiol Rev 2000; 13: 662-685.
- Ferrer C, Colom F, Frasés S, Mulet E, Abad JL, Alió
JL. Detection and identification of fungal pathogens by PCR and by
ITS2 and 5.8S ribosomal RNA typing in ocular infections. J Clin
Microbiol. 2001; 39: 2873-2879.
- McLeod S, Kumar A, Cevallos V, Srinivasan M, Whitcher JP.
Reliability of transport medium in the laboratory evaluation of
corneal ulcers. Am J Ophthalmol 2005; 14: 1027-1031.
- Mills DM, Bodman MG, Meyer DR, Morton AD 3rd; ASOPRS
Dacryocystitis Study Group. The microbiologic spectrum of
dacryocystitis: a national study of acute versus chronic infection.
Ophthal Plast Reconstr Surg. 2007; 23: 302-306.
- Sharma S, Kunimoto DY, Gopinathan U, Athmanathan S, Garg P, Rao
GN. Evaluation of corneal scraping smear examination methods in the
diagnosis of bacterial and fungal keratitis. Cornea 2002; 21:
643-647.
- Schuster FL. Cultivation of pathogenic and opportunistic
free-living amebas. Clin Microbiol Rev. 2002; 15: 342-354.
- Tarabishy AB, Hall GS, Procop GW, Jeng BH. Bacterial culture
isolates from hospitalized pediatric patients with conjunctivitis.
Am J Ophthalmol 2006; 142: 678-680.
- Thompson PP, Kowalski RP, Shanks RM, Gordon YJ. Validation of
real-time PCR for laboratory diagnosis of Acanthamoeba
keratitis. J Clin Microbiol. 2008; 46: 3232-3236.
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